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唾液酸是一类含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖,又称神经氨酸;唾液酸在自然界中分布广泛,且种类繁多,迄今已发现超过60种唾液酸。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是最重要的一种唾液酸,是其他唾液酸合成的前体物质,与人类的健康关系最为密切;Neu5Ac可以用于合成抗病毒药物,治疗H1N1和H5N1流感等疾病。此外,Neu5Ac也有很大的营养价值,它能促进婴儿的大脑发育,同时对维持早产儿脑功能和健康也有积极作用。目前制备和生产Neu5Ac常用的方法是酶催化法,该方法产量虽高,但需要添加过量的丙酮酸导致原料浪费、产品纯化困难以及环境压力增大。本论文尝试建立一个不依赖丙酮酸的Neu5Ac合成方法:以N-乙酰葡萄糖胺(Glc NAc)为底物,在N-乙酰葡萄糖胺异构酶(AGE)的催化下异构化为N-乙酰甘露糖胺(Man NAc);然后,在Neu5Ac合成酶(Neu B)的催化下,与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)发生不可逆反应合成Neu5Ac。在大肠杆菌中构建上述Neu5Ac合成途径,并利用代谢工程和发酵工程方法强化Neu5Ac的合成。主要结论如下:(1)分别考察不同来源的AGE和Neu B的活性及酶学性质,对比得到在大肠杆菌中表达活性最高的酶。结果表明,猪肾脏中p AGE和项圈藻中b AGE的稳定性、温度偏好和p H偏好性相似,其最适p H均为7.0,最适温度均为50°C,并且在35-55°C范围内保持较高活性,达到其在50°C时活性的90%以上。在37°C Tris-HCl(p H 7.0)条件下,p AGE和b AGE活性分别为392.1和2411.5 U?mg-1总蛋白。此外,e Neu B和c Neu B的最适p H均为中性,且最适温度均为45°C,在30-47.5°C范围内保留超过60%的活性。在37°C Tris-HCl(p H 7.0)条件下,e Neu B和c Neu B活性分别为0.037和6.380 U?mg-1总蛋白。而c Neu B的稳定性不佳,2 h后仅有50%的催化活性保留。当与分子伴侣质粒p Gro7共表达时,测得的c Neu B活性比对照组提高17.8%;其诱导表达的Gro EL/Gro ES复合体,能阻止蛋白质的错误聚集并提高蛋白质的折叠速度,提高大肠杆菌可溶性表达c Neu B的能力。因此考虑基于b AGE和c Neu B两种酶构建Neu5Ac合成途径。(2)基于b AGE和c Neu B,构建Neu5Ac合成途径;分别敲除宿主菌的Neu5Ac分解途径和Glc NAc跨膜转运途径的相关基因,促进Neu5Ac的合成。由于c Neu B活性远小于b AGE,因此重点关注体系中的c Neu B催化活性。对调两个基因的次序,分别得到共表达载体p DTrc-AB和p DTrc-BA,发现p DTrc-AB中cneu B基因位于下游其表达活性更高。宿主大肠杆菌中的Neu5Ac分解途径保留时,无法实现Neu5Ac的积累;利用Red重组系统敲除nan ATEK基因簇后,得到E.coli SA-01,其Neu5Ac分解途径被阻断;将共表达载体p DTrc-AB和p DTrc-BA分别转化E.coli SA-01,经诱导后的菌体成功实现Neu5Ac的合成,Neu5Ac合成量分别为2.61和2.03 g?L-1。改造Glc NAc跨膜转运途径,避免底物Glc NAc与PEP在旁路上的无效消耗,增加胞内底物Glc NAc浓度和PEP供给,强化了Neu5Ac的合成,Neu5Ac合成量提高38.3%,达到3.61 g?L-1。(3)将大肠杆菌中PEP合成相关基因单独或共同过表达,提高胞内PEP的供给,进一步促进了Neu5Ac的合成。从E.coli MG1655基因组中克隆得到PEP合成相关基因pck和pps A,利用Duet系列载体构建两个基因的单独过表达和共过表达载体,并导入DE3溶源化的E.coli。当pck和pps A单独过表达时,Neu5Ac合成量分别为5.80和7.09 g?L-1。当pck和pps A共同过表达时,两个基因的转录水平同步提高,并正相关于载体的拷贝数。最优的PEP强化供给系统由中拷贝载体p CDF-pck-pps A构成,此时Neu5Ac合成量达到8.63 g?L-1,比出发菌株提高139%。(4)考察生物转化阶段合成Neu5Ac的营养条件以及表面活性剂对Neu5Ac合成的影响,优化Neu5Ac合成过程,并在发酵罐中实现Neu5Ac的高效合成。在含有氮源的培养基中,宿主大肠杆菌大量生长,而Neu5Ac的合成受到抑制;在无氮葡萄糖培养基中,宿主大肠杆菌生长受到限制,而Neu5Ac的合成抑制解除,合成量达到8.61 g?L-1。当宿主大肠杆菌生长旺盛时会消耗PEP,与Neu5Ac合成竞争胞内的PEP,反而不利于Neu5Ac的合成。当甘油为碳源时,其跨膜转运不依赖于PTS,节省胞内PEP从而使其更多流向Neu5Ac合成方向,Neu5Ac合成量也随之提高到10.43 g?L-1。转化培养基中添加Triton X-100,对Neu5Ac合成有一定的促进作用,但仅为6.1%。最后,在发酵罐中进行生物转化合成Neu5Ac过程,培养基中磷酸盐浓度大幅降低,减小了反应体系渗透压力;同时发酵罐中更好的传质状况,有利于Neu5Ac的合成。在发酵罐中65 h合成Neu5Ac达到16.02 g?L-1,比同条件摇瓶水平显著增加53.6%,实现了Neu5Ac的高效合成。