目的:研究巨噬细胞KLF5影响心肌细胞的衰老的功能及其分子机制。KLF5是KLFs家族中的一员,它在调节各种细胞生物学过程起着关键作用,包括增殖﹑迁移﹑分化﹑生长﹑存活和凋亡。KLF5作为心脏的一个关键转录因子,在心血管系统中高表达,介导心脏结构和功能相关的基因表达。CircRNA是一类非常稳定的新型非编码RNA,是5′端帽或3′端聚（A）尾部缺少闭合连续的环状结构。CircRNA比线性RNA稳定,不受RNA外切酶、脱帽或腺基化的影响。有研究证明,某些circRNA可作为有效的mi RNA海绵发挥作用,并具有潜在调控功能。大量文献报道,circRNA可以作为信息传递分子,参与不同细胞之间的相互作用。心肌细胞、心肌巨噬细胞和心肌成纤维细胞是心肌组织的主要细胞类型。我们的研究发现,平滑肌细胞过表达KLF5能促进巨噬细胞迁移,从而促进以平滑肌病变为主的动脉瘤的形成。因此,我们推测巨噬细胞KLF5的变化也可能通过某种途径,例如circRNA,影响心肌细胞从而参与心肌细胞缺氧损伤过程,且可能成为心肌细胞缺氧损伤治疗的靶点。因此,本文主要研究巨噬细胞中KLF5是否参与缺氧诱导的心肌细胞的衰老及其分子机制。方法:1. 骨髓来源的巨噬细胞分为常氧组和缺氧组,用CCK-8检测巨噬细胞增殖情况。2.将心肌细胞分为四组:心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5^wt或者Ad-GFP常氧的巨噬细胞培养基4:1混合)常氧培养;心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5^lysm-/-或者Ad-KLF5常氧的巨噬细胞培养基4:1混合)常氧培养;心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5^wt或者Ad-GFP缺氧的巨噬细胞培养基4:1混合)缺氧培养;心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5^lysm-/-或者Ad-KLF5缺氧的巨噬细胞培养基4:1混合)缺氧培养。CCK-8检测心肌细胞的细胞活力;β-半乳糖苷酶检测心肌细胞的衰老情况;鬼笔环肽检测心肌细胞肌丝分布情况;Western Blot检测缺氧早期抑制衰老和凋亡基因的表达;RT-PCR检测心肌细胞中P21^cip1、P16^INK4a、Caspase3、circ-KHK、circ-dnmt3a、circ-HIF1α、circ-FOXO1的表达水平。结果:1. 缺氧早期促进骨髓来源小鼠巨噬细胞增殖将骨髓来源的巨噬细胞分为常氧组和缺氧组,CCK-8结果显示,缺氧6-26小时显著促进巨噬细胞增殖,但是缺氧48小时之后,巨噬细胞增殖活性受到显著的抑制,说明缺氧早期促进骨髓来源小鼠巨噬细胞增殖。2. 巨噬细胞敲低KLF5可以延缓心肌细胞衰老和凋亡CCK-8结果显示,无论在常氧还是缺氧环境中,巨噬细胞敲低KLF5都会显著增强心肌细胞的细胞活力。β-半乳糖苷酶染色显示,巨噬细胞敲低KLF5可以减缓心肌细胞的衰老和凋亡。与上述结果吻合,鬼笔环肽结果显示巨噬细胞敲低KLF5能稳定心肌细胞肌丝的束状均匀分布,抑制心肌细胞骨架的解聚。这些结果都表明巨噬细胞敲低KLF5可以延缓心肌细胞的衰老和凋亡。3. 巨噬细胞敲低KLF5抑制心肌细胞衰老和凋亡标志基因表达Western Blot显示,KLF5^lysm-/-小鼠巨噬细胞KLF5敲低较为成功。进一步检测心肌细胞衰老和凋亡相关蛋白的表达发现,不论在缺氧还是常氧的环境中,巨噬细胞敲低KLF5抑制心肌细胞中P16^INK4a的蛋白表达。而P21^cip1的蛋白表达在缺氧时与P16^INK4a一致,但在常氧时其蛋白表达却是上调。RT-PCR显示,在心肌细胞中P16^INK4a、Caspase3和P21^cip1在巨噬细胞敲低KLF5时显著降低。4.巨噬细胞过表达KLF5促进心肌细胞衰老和凋亡Western Blot显示巨噬细胞中KLF5蛋白过表达明显,说明过表达成功。CCK-8结果显示,在缺氧的情况下,巨噬细胞过表达KLF5抑制心肌细胞的细胞活力。β-半乳糖苷酶结果显示,巨噬细胞过表达KLF5能加速心肌细胞的衰老。鬼笔环肽结果显示,巨噬细胞过表达KLF5能破坏心肌细胞的细胞骨架束状分布。Western Blot结果显示巨噬细胞过表达KLF5、P16^INK4a、Caspase3和P21^cip1蛋白的表达量明显增加,RT-PCR结果显示巨噬细胞过表达KLF5时P21^cip1、Caspase3表达明显上调。以上结果说明巨噬细胞过表达KLF5促进心肌细胞的衰老和凋亡与上调P16^INK4a、P21^cip1和Caspase3蛋白有关。5.CircRNA参与巨噬细胞和心肌细胞的相互作用RT-PCR结果显示,巨噬细胞敲低KLF5时,心肌细胞circ-KHK、circ-HIF1α、circ-FOXO1表达显著下降,而circ-dnmt3a显著升高。相反在巨噬细胞过表达KLF5时,心肌细胞circ-KHK、circ-HIF1a、circ-FOXO1、circ-dnmt3a这四种circRNA显著降低,提示巨噬细胞KLF5可能通过影响心肌细胞circRNA表达调控心肌细胞衰老。结论:1.缺氧早期促进骨髓来源小鼠巨噬细胞增殖。2.巨噬细胞敲低KLF5可延缓心肌细胞的衰老。3.巨噬细胞敲低KLF5通过下调P16^INK4a、P21^cip1表达延缓心肌细胞衰老。4. 巨噬细胞过表达KLF5,加速心肌细胞的衰老。5. Circ-dnmt3a可能参与巨噬细胞与心肌细胞间的相互作用。