结核病是一种由结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病,与艾滋病和疟疾一起成为当今世界威胁人类健康的三大传染病。近年来由于人口流动增加、结核杆菌多重耐药性的出现和卡介苗长期繁衍、传代导致保护性抗原不断丢失、变异,最终使结核病的疫情再度加重,给结核病的防治提出新的挑战。因此研制开发新型、安全、高效的结核病疫苗势在必行。ESAT6蛋白(早期分泌蛋白抗原靶6)是从结核分枝杆菌短期培养滤液中纯化的一种分泌性蛋白,有特异的免疫原性,能刺激机体产生保护性免疫反应。ESAT6分子量为6KD,其编码基因全长为288bp,可编码95个氨基酸。它仅存在于结核分枝杆菌及少数几种致病性分枝杆菌中,而90%以上的非致病性分枝杆菌菌株缺失该蛋白。Brandt等发现ESAT6是分枝杆菌感染的人或动物免疫应答过程中T细胞识别的主要靶抗原之一。同时Skjot发现ESAT6能诱导机体产生高水平的IFN-γ,它在结核病的防治中发挥比较重要的作用。因此ESAT6蛋白可作为亚单位疫苗的组分以及成为DNA疫苗的候选抗原,从而达到对结核病长期、有效的预防。目前国内外学者在结核分枝杆菌ESAT6的高效表达及疫苗的研制方面进行了许多研究,已取得了一系列研究成果。目前基因工程中蛋白表达有多种体系,其中大肠杆菌是最为主要的表达系统。其主要优点是成本低、易于操作。但大肠杆菌是原核生物,不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力,而且蛋白的表达量低、活性差,因此人们转向真核表达体系。目前真核表达体系中最常用的是毕赤酵母表达系统,人们利用它已成功地表达了多种外源蛋白。外源蛋白在毕赤酵母中的表达分胞内表达和分泌到胞外两种方式。胞内表达适宜于通常在胞浆中表达或不含-S-S-键的非糖基化蛋白,但产物纯化较复杂。对于那些易于降解的不稳定蛋白或具有毒素活性及对宿主菌有毒害作用的蛋白,胞内表达可以将它们存储在广泛存在于甲醇酵母细胞内的特异性细胞分隔—过氧化物酶体中。巴斯德毕赤酵母包外分泌表达时只分泌很低水平的内源蛋白,外源蛋白纯化非常方便,故分泌表达一般为优先选择的方式。本研究主要目的是构建结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体并转入毕赤酵母中进行表达,同时对表达条件进行优化。以人结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,扩增结核杆菌分泌性蛋白ESAT6基因,并连接到PGEM-T载体上。在此基础上将ESAT6基因连接到PpIczaA上,构建毕赤酵母表达载体。将其线性化后,用电穿孔法导入PichiaPastoris Gs115中。采用Zeocin进行梯度筛选高抗性转化子。以甲醇作为诱导物,取摇床发酵培养4d后的上清液,进行SDS-PAGE。同时为了提高蛋白的表达量,采用正交实验来优化毕赤酵母的发酵条件,其影响发酵的主要因素有:溶液pH值、甲醇加入量、温度、发酵天数。最终得到重组毕赤酵母发酵过程中各项影响因素最佳值,即pH5.5,甲醇加入量为1%,温度为30℃,时间为4d。综上所述,本研究实现了ESAT6基因在毕赤酵母中的分泌表达,获得了具有生物活性的ESAT6,分泌表达量达30mg/L。ESAT6在真核体系内的成功表达不仅解决了原核表达后要经过的变性复性问题,而且也为新型疫苗的研制和结核病的防治奠定了基础。