【摘 要】
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目的:尿道狭窄的治疗是泌尿外科医生困扰的难题之一。无论是腔内切除或是药物治疗的疗效都不明显。目前有文献报告间充质干细胞（MSC）用于治疗尿道狭窄取得了一定的疗效,但是其作用的分子机制还未阐明。本研究利用IL-1β诱导人脐带血来源的间充质干细胞外泌体作用于新西兰兔尿道狭窄模型,研究其作用及可能的分子机制。方法:运用超高速离心法提取MSC的外泌体,验证外泌体表型蛋白、粒径检测及电镜观察外泌体形态。使用
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目的:尿道狭窄的治疗是泌尿外科医生困扰的难题之一。无论是腔内切除或是药物治疗的疗效都不明显。目前有文献报告间充质干细胞（MSC）用于治疗尿道狭窄取得了一定的疗效,但是其作用的分子机制还未阐明。本研究利用IL-1β诱导人脐带血来源的间充质干细胞外泌体作用于新西兰兔尿道狭窄模型,研究其作用及可能的分子机制。方法:运用超高速离心法提取MSC的外泌体,验证外泌体表型蛋白、粒径检测及电镜观察外泌体形态。使用转换因子β1（TGF-β1）诱导动物模型。分别于新西兰兔阴茎部位尿道。实验分为四组:分别为空白对照组,TGF-β1组（只注射TGF-β1）,MSC-exo+TGF-β组（注射TGF-β1和未经处理的MSC-EXO）和MSCIL-1β-exo+TGF-β组（注射TGF-β1和经IL-1β诱导的MSC-EXO）。2月后,行尿路造影评估新西兰兔的尿道狭窄情况后处死新西兰兔获取尿道组织行组织学和细胞学分析。体外实验中,通过Western blot,q RT-PCR和流式细胞术检测control组,MSCs共培养组,MSCIL-1β共培养组和外泌体组的巨噬细胞其表型标志物的变化和其微环境中炎性相关细胞因子分泌的改变及其作用成纤维细胞后纤维化相关蛋白表达的改变,通过Transwell共培养技术验证巨噬细胞极化的机制在成纤维细胞迁移中的作用。通过q RT-PCR测定被MSCIL-1β-exo处理过的巨噬细胞中mi R-92a的表达情况;Western blot和q RT-PCR检测用或不用mi R-92a抑制剂,其PTEN、p-Akt、和p-P65通路蛋白及m RNA的表达变化情况。明确巨噬细胞极化的具体机制。结果:通过Western blot检测外泌体其标志性蛋白、粒径检测外泌体的粒径和电镜下观察外泌体的形态结果证实提取到外泌体。新西兰兔尿路造影图像显示:与TGF-β1组相比,MSCIL-1β-exo+TGF-β组和MSC-EXO+TGF-β组的尿道狭窄程度明显减轻,且MSCIL-1β-exo+TGF-β组的尿道狭窄较MSC-EXO+TGF-β组程度减轻。Masson三色染色和H＆E染色显示在MSCIL-1β-exo组中的组织纤维化程度较TGF-β1组显著降低,在免疫组织化学结果中也显示了MSCIL-1β-exo组中的αSMA的表达较TGF-β1组明显降低。体外实验中,Western blot及q RT-PCR实验结果显示:与对照组相比,Arg-1表达在外泌体组中显著升高且随着外泌体浓度的升高而升高,而INOS、IL-6显著降低。在流式细胞术中:较control组而言,exsome刺激组和MSCs共培养组中表达CD206蛋白的细胞比例明显低于升高,而且MSCIL-1β-exo组中表达CD206标志蛋白的细胞比较略高于MSC-EXO组和MSCs共培养组。在transwell共培养技术检测极化的巨噬细胞对成纤维细胞募集作用的实验中发现:与control组相比,antagormi R-92a组和MSCIL-1β-exo共培养组中迁移到下室的细胞数明显增减少,然而在antagormi R-92a NC组中迁移的细胞情况与control组相似。与mi R-92a类似物组相比,mi R-92a类似物阴性对照组中的α-SMA、Collagen I和CollagenⅢ的蛋白和m RNA表达水平显著降低,（P<0.05）。通过对Western blot及q RT-PCR的实验结果分析发现:在使用IL-1β刺激MSCs来源的外泌体作用巨噬细胞内后使其mi R-92a表达显著降低。Western blot及q RT-PCR检测结果显示:较对照组及LPS+IFN-y组来说,在mi R-92a抑制剂转染组中,导致PTEN显著上调、（mi R-92a的已知靶标）其下游蛋白p-Ikkα/β、p-AKT、p-p65（PTEN下游蛋白）的表达下调（P<0.05）,而在mi R-92a抑制剂阴性对照组中的结果又与其相反。结论:IL-1β预处理MSC的外泌体通过抑制巨噬细胞内源性mi R-92a的表达促使PTEN的表达上调,来抑制PI3K/Akt/NF-k B信号通路,促进巨噬细胞向M2极化,减弱巨噬细胞和成纤维细胞的聚集,从而抑制成纤维细胞的活化及减少胶原蛋白的产生,最后达到抑制尿道狭窄的效果。
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