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植物细胞壁多糖的酶解在多种工业过程中均具有重要意义。半纤维素和果胶侧链上的阿拉伯呋喃糖是许多植物细胞壁中的重要组分。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶能够从这些多糖中水解出L-阿拉伯糖,并可以有效提高木聚糖到木糖的转化效率和促进生物质的整体降解,在淀粉加工、饲料酶添加以及生物燃料生产等众多领域具有重要应用。另外,植物细胞壁中的半纤维素结构复杂,侧链上的阿拉伯呋喃糖苷一方面与木聚糖骨架相连,另外还可通过与阿魏酸或对香豆酸形成酯键,进而与其他阿拉伯木聚糖链或木质素交联形成会严重阻碍木质纤维素底物充分降解的网状结构,所以木质纤维素生物质的充分降解往往需要一系列半纤维素酶的协同作用。在已有菌株高产纤维素酶的基础上进一步优化半纤维素酶组分,有利于提高对富含半纤维素底物的水解效率,提升生物质能源转化的经济性。草酸青霉Penicillium oxalicum是工业上重要的生产木质纤维素降解酶的丝状真菌,其基因组中含有丰富的半纤维酶基因。通过基因工程手段构建包括阿拉伯呋喃糖苷酶在内的半纤维素酶高产菌株、挖掘更多优质的阿拉伯呋喃糖苷酶资源,有利于优化木质纤维素降解酶系和提升对半纤维素的开发和利用水平,可进一步推动复杂多糖的酶解工艺的发展。本论文主要对草酸青霉Penicillium oxalicum中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶系进行了研究,并构建了草酸青霉多种半纤维素酶高产菌株,主要研究内容和结果如下:1.转录因子AraR突变体对草酸青霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶系的影响基于草酸青霉转录因子AraR和XlnR的序列相似性,将调控蛋白AraR的第731位的丙氨酸突变为缬氨酸,构建了 AraR的持续性激活突变体。在依赖纤维素诱导的草酸青霉纤维素酶高产菌株CXC中利用组成型启动子过表达突变体AraRA731V,得到重组菌株CXC-gAraRA731V。在饥饿条件下,菌株CXC-gAraRA731V可以合成α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶,且酶活力水平与出发菌株在诱导条件下的水平相当;在诱导条件下,菌株CXc-gAraRA731V的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力较出发菌株CXC提高了 54倍,在120 h时达到了 28.7 U/mL,该值高于目前文献中报道的水平。CXC-gAraRA731V中有11个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和/或β-木糖苷酶基因的转录水平较CXC显著上调。此外,菌株CXC-gAraRA731V的α-半乳糖苷酶活力相比出发菌株CXC提升了 7.4倍,α-半乳糖苷酶基因aga27A的表达量上调了 17.4倍。对天然底物阿拉伯树胶进行酶解,在同等蛋白质用量的条件下,经CXC-gAraRA731V的粗酶液水解产生的还原糖浓度为0.98 g/L,是CXC粗酶液的4.5 倍。2.草酸青霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶组分的克隆与表达为了构建草酸青霉蛋白表达系统,利用组成型启动子PubiC或PpgmA连接草酸青霉来源的cbh1,以草酸青霉尿嘧啶营养缺陷型菌株M12作为蛋白表达宿主,以pyrG作为筛选标记基因;将获得的重组菌株在葡萄糖条件下进行发酵培养,实现了目的蛋白CBH1的高效表达,重组菌株的发酵粗酶液具有纤维二糖水解酶活性。利用上述蛋白表达系统成功表达了草酸青霉基因组注释中预测的7个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶,并测定了粗酶液对合成底物pNPA的水解活性,发现仅 Abf51A（PDE06546）和 Abf54A（PDE09988）具有明显的pNPAase 活力,其他蛋白对合成底物pNPA无明显水解活性。3.草酸青霉半纤维素酶高产菌株的构建在菌株CXC-gAraRA731V中进一步敲除碳分解代谢物阻遏因子CreA,获得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶高产菌株gAraRA731V-ΔcreA。菌株gAraRA731V-ΔcreA的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的产量达到了 64.48 U/mL,是目前已报道的丝状真菌中的最高水平。另外,CreA的敲除使得菌株发酵液中的主要纤维素酶活力和半纤维素酶活力均有不同程度的提升,菌株gAraRA731V-ΔcreA的胞外粗酶液对玉米皮的降解效率也明显高于出发菌株。通过对β-葡萄糖苷酶基因bgl2和半纤维素酶组分编码基因进行组合遗传操作,分别成功构建了高产β-木糖苷酶和阿魏酸酯酶的草酸青霉菌株。在纤维素酶高产菌株RE-6中敲除bgl2同时过表达β-木糖苷酶基因xyl3A获得菌株RX6,其纤维素酶活力明显高于出发菌株,β-木糖苷酶活力达到了 22.18 U/mL,是出发菌株的38.2倍;在菌株RX2中,利用bgl2的启动子过表达了xyl3A,其β-木糖苷酶活力达到47.76 U/mL,是出发菌株RE-6的82.3倍;在RE-6中敲除bgl2同时过表达fae1A获得菌株RF2和RF3,其阿魏酸酯酶活力分别为6.25 U/mL和6.38 U/m,约为出发菌株的2倍,且各种纤维素活力也发生不同程度的提升。