星形细胞肿瘤(astrocytoma)是人类常见的恶性脑肿瘤之一,也是脑胶质瘤中最常见的病理类型。现已证明星形细胞肿瘤的形成与一定的内环境改变和基因变异有关,是一个多因素、多步骤的癌基因激活和抑癌基因失活参与的协同积累过程,但是星形细胞肿瘤的发病原因尚无定论,需要进一步研究。Axin是1997年发现的,最初被认为是Wnt通路的抑制因子,后来的研究显示其能够负性调控胚胎的体轴发育。进一步的研究表明Axin还是抑癌基因,与多种肿瘤的发生发展密切相关。然而,目前Axin在星形细胞肿瘤发生与发展过程中的作用及机制尚不明确。本课题对Axin在不同级别的星形细胞肿瘤中的表达水平变化,以及其与星形细胞肿瘤的发生发展关系进行了研究,同时通过Axin过表达/沉默表达探讨其对星形细胞肿瘤的影响及其作用机制。【目的】1.研究Axin的表达与星形细胞肿瘤发生发展的相关性;2.从功能方面探讨Axin对星形细胞肿瘤细胞生长和凋亡的影响;3.研究Axin对星形细胞肿瘤细胞生长和凋亡的影响机制;4.探讨Axin下游分子β-catenin的表达分布,及其与星形细胞肿瘤患者预后的关系。【方法】1.利用反转录PCR(RT-PCR)和免疫组化的方法检测Axin在不同级别星形细胞肿瘤组织中的表达变化;2.构建Axin真核表达载体,并通过脂质体转染和G418筛选建立稳定高表达Axin的星形细胞肿瘤C6细胞系;3.设计合成Axin特异性siRNA,沉默Axin基因的表达;4.利用MTT实验、流式细胞仪、克隆形成实验、TUNEL染色、Hoechst染色等研究Axin对星形细胞肿瘤细胞C6生长和凋亡的影响;5.通过反转录PCR或Real-time PCR检测细胞中相关基因的mRNA水平变化;6.通过Western blot检测细胞中相关蛋白的表达水平;7.用免疫组织化学染色的方法检测β-catenin在星形细胞肿瘤中的表达和细胞定位,分析β-catenin的表达与患者预后的关系。【结果】1. Axin的表达水平与星形细胞肿瘤的级别相关我们利用RT-PCR检测了不同级别星形细胞肿瘤中Axin mRNA的表达情况,发现2例WHO II级星形细胞肿瘤中均可检测到Axin mRNA,2例WHO III级间变型星形细胞肿瘤中有1例检测到Axin mRNA,而2例WHO IV级胶质母细胞瘤中没有发现Axin mRNA;对96例不同级别星形细胞肿瘤的免疫组织化学染色结果显示,Axin主要分布在肿瘤细胞的胞浆;33/96例星形细胞肿瘤Axin表达阳性(34.4%),其中23/49例(46.9%)为WHO II级星形细胞肿瘤,8/31例(25.8%)为WHO III级间变型星形细胞肿瘤,2/16(12.5%)例为WHO IV级胶质母细胞瘤;Spearman相关性统计分析表明Axin的表达水平与星形细胞肿瘤的分级呈负相关;但与患者的年龄、性别和肿瘤的发生部位无相关性。结果显示Axin随着星形细胞肿瘤级别的增高,其表达率降低,提示Axin在星形细胞肿瘤的进展过程中发挥重要作用。2. Axin明显抑制星形细胞肿瘤C6细胞增殖并诱导其凋亡流式细胞仪分析结果显示,Axin过表达使G2+S期细胞的分布比例降低而G1期被阻滞,而用siRNA Axin沉默Axin基因后与对照组细胞相比G2+S期细胞的分布比例上升;MTT实验结果显示,过表达Axin细胞组的细胞增殖水平明显低于对照组细胞的增殖水平,转染Axin组的细胞生长受到明显的抑制,且随着时间的推移,抑制程度明显增加;同样,过表达Axin使细胞的克隆形成能力明显低于对照组细胞;TUNEL和免疫荧光检测结果显示过表达Axin的细胞凋亡率明显高于对照组细胞的凋亡率。综合以上结果说明,Axin可诱导星形细胞肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖,Axin在星形细胞肿瘤中发挥肿瘤抑制因子的功能。3. Axin主要通过p53通路抑制星形细胞肿瘤细胞C6生长并诱导其凋亡我们的预实验(RT-PCR)显示,过表达Axin后,mRNA表达量变化最明显的为p53基因,而β-catenin的总表达量无明显改变。我们进一步利用Real-time PCR方法检测p53及其下游基因的mRNA表达情况,同时通过Western blot的方法检测p53及下游相关蛋白的表达。结果发现,转染pIRES2-EGFP-Axin组p53的mRNA表达量比未转染对照组明显升高(与RT-PCR结果一致),p21的mRNA水平也相应升高,而Cyclin D1的mRNA水平下降;同样,Western blot也显示p53和p21的蛋白表达水平升高,而Cyclin D1的蛋白水平下降;此外,Axin过表达后,p53通路中与凋亡相关的重要分子Bax的表达量亦增高。用p53的特异性抑制剂pifithrin-α处理细胞后,pifithrin-α处理组与未处理组相比,p53和p21的表达量出现降低,而Cyclin D1的表达量升高,Bax的表达量降低;而且,用pifithrin-α处理组细胞的凋亡指数为19.5%,亦明显低于未处理组(36.5%);而对照组的细胞的凋亡指数用pifithrin-α处理前后没有明显变化;用pifithrin-α处理组G2+S期细胞分布(36.2%)高于未处理组(25.4%),而G1期细胞分布(63.8%)低于未处理组(74.6%),然而对照组(未转染Axin组)用pifithrin-α处理前后在G2+S期和G1期的细胞分布没有明显变化。以上结果提示,p53抑制剂pifithrin-α可逆转由Axin诱导的p53及其下游基因的表达,从而抵抗Axin过表达所致的星形细胞肿瘤细胞C6生长的抑制,同时,由Axin诱导的星形细胞肿瘤细胞C6的凋亡作用也受到抑制,说明在星形细胞肿瘤中,p53通路参与了Axin所产生的生长抑制和诱导凋亡作用。为了确定星形细胞肿瘤中β-catenin在Axin的诱导凋亡和生长抑制中的作用,我们采用RT-PCR的方法检测β-catenin mRNA的表达水平,发现其总量没有发生改变。然而,Western blot结果显示未转染Axin前,胞浆内的β-catenin含量比胞核内多,而转染Axin后,胞浆内的β-catenin比细胞核内的减少。进一步用免疫细胞化学染色检测转染Axin前后β-catenin含量的变化,转染Axin后,β-catenin胞核表达阳性的细胞数比转染空载体的细胞数量增多。4.β-catenin表达量高的星形细胞肿瘤患者的预后差尽管没有证据显示Axin在星形细胞肿瘤中能够直接影响β-catenin的表达水平,但是作为Wnt通路中的重要分子,β-catenin对星形细胞肿瘤可能有一定的影响。我们对65例星形细胞肿瘤组织标本进行了β-catenin的表达分布检测,发现β-catenin在肿瘤细胞胞浆、胞膜和胞核中均有表达,Spearman相关性分析结果显示星形细胞肿瘤的级别与β-catenin的分布(细胞浆、细胞膜、细胞核)没有相关性,表明β-catenin的核易位与星形细胞肿瘤的整体恶性程度无关;通过对不同级别星形细胞肿瘤进行分析还发现,β-catenin的表达(包括细胞浆、膜和核)与星形细胞肿瘤的级别无相关性;而且,β-catenin的表达与肿瘤大小、年龄、性别和发生部位等均没有相关性;但是通过对β-catenin的表达与患者两年生存率的相关性进行研究发现,β-catenin的表达与患者两年生存率有相关性,患者两年生存率随着β-catenin表达量的增高而下降;生存曲线显示,β-catenin高表达的患者预后比低表达的患者预后差。【结论】本研究发现Axin是一个与星形细胞肿瘤发生发展密切相关的基因,其表达随着星形细胞肿瘤级别的增高而降低;同时我们发现在星形细胞肿瘤中Axin通过p53通路抑制星形细胞肿瘤细胞C6的增殖并诱导其凋亡;而作为Axin下游基因,β-catenin在星形细胞肿瘤细胞浆、核、膜不同部位的分布与星形细胞肿瘤的恶性程度无明显相关性,但是β-catenin的表达与患者的预后密切相关。