论文部分内容阅读
小麦白粉病是影响我国小麦生产的主要病害，培育抗病品种是防治病害的经济有效的途径；而抗病基因的研究则是抗病育种的基础。目前，已定名的抗小麦白粉病基因有29个位点，45个主效基因，并已进行了染色体定位及找到了相应的分子标记，但仍没有一个抗病基因克隆成功。本研究以引自原苏联的簇毛麦为白粉病抗源选育的6D/6V代换系RW15为供试材料，以染色体显微切割技术为主线，进行6V染色体上抗白粉病基因的克隆，主要研究内容是：创制6VS单端体、双端体异代换系材料；构建、筛选6VS特异文库；利用已克隆抗病基因的保守域设计引物，从6VS端体扩增抗病基因同源序列；构建小麦-簇毛麦易位系的cDNA文库，并以抗病基因同源片段为探针对文库进行筛选，获得如下主要结果：1.利用组织培养、抗病性鉴定、细胞遗传学分析和原位杂交获得了6VS/6D 单端体、双端体异代换系H1-2和H1-2-6。2.采用玻璃针显微切割、“单管”技术体系及LA-PCR，构建了6VS DNA特 异质粒文库。文库含有17000个重组克隆，插入片段长度从100-1500bp， 平均600bp；63%的插入序列克隆为单/低拷贝，37%为多拷贝。3.从文库中筛选到5个多拷贝簇毛麦专化序列pHVMK134、pHVMK137、 pHVMK125、pHVMK130和pHVMK67。3个簇毛麦专化单拷贝序列pHVMK22、 pHVMK15和pHVMK129。其中，pHVMK22可以作为探针在小麦遗传背景下 进行簇毛麦抗白粉病基因的检测。4.利用已克隆抗病基因的保守域设计了7对引物，从6VS端体DNA中扩 增出10类抗病基因同源片段Hvrgak1-Hvrgak10（GenBank登录号为 AF387113-AF387120，AY040671，AY040672）。抗病同源序列与小麦抗 白粉病基因的连锁分析表明，Hvrgak2、Hvrgak4和Hvrgak5与抗病基 因相关。5.构建了小麦-簇毛麦易位系的cDNA文库，克隆载体为λZAP。文库滴度 为3.5×10~5，插入片段0.4-4.3kb，平均1.8kb。6.从cDNA文库的1.2×10~6个克隆中经两次筛选获得四个阳性克隆：kong1 插入片段2.9kb；kong28，插入片段1.3kb；kong32，插入片段1.2kb； kong36，插入片段1.1kb。对这些插入片段的Southern分析表明均为阳 性。7．利用差异显示技术共获得10个差异。DNA片段，有两个Northern分析为 阳性。序列分析表明，R3习为 840hp，在 GenBank中没有发现同源性较高 的植物基因序列；8CI．36为 587hp，同玉米的 tbl基因＊七8区段有 100％ 同源性，与 sphenostylis stenoc地a Ill类几丁质酶基因 15－56区段有 100％同源性。