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我国水产养殖业发展迅速,但细菌疾病的爆发,给水产养殖业带来了巨大的经济损失,而传统的酶联免疫分析法、荧光抗体法等免疫检测方法均存在灵敏度低、背景荧光高等缺陷。时间分辨荧光免疫法可有效降低背景荧光,是一种灵敏、高效的检测手段,已在致病菌、有毒化合物等免疫检测上得到了广泛地应用。纳米粒子可与多种生物大分子结合包括抗体,且不影响其生物活性,本研究建立了一种基于纳米粒子的TRFIA检测水产养殖致病菌,研究内容如下:(1)建立了直接纳米粒子TRFIA法检测嗜水气单胞菌B15,将细菌包被于微孔板,抗体标记后的荧光纳米粒子作为检测抗体进行检验。采用正交试验对细菌包被时间、细菌包被温度、纳米粒子-抗体浓度进行了优化,得出嗜水气单胞菌的最低检测限为1.0×10~5cfu/mL。(2)为提高检测灵敏度,将嗜水气单胞菌B15的抗体直接包被于微孔板,建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA法。正交试验法对包被抗体浓度、抗体包被时间、免疫反应时间以及纳米粒子-IgG浓度进行了优化。根据优化结果进行实验,得出最低检测线为1.0×10~3cfu/mL。(3)引入生物素-链霉亲和素系统检测嗜水气单胞菌B15,进一步提高灵敏度。将生物素标记嗜水气单胞菌B15的抗体,使用链霉亲与荧光纳米粒子偶联,建立了生物素亲合素(Biotin-Avidin,BA)-纳米粒子TRFIA法。采用正交试验法优化生物素化抗体浓度、生物素化抗体与BA-荧光纳米粒子结合时间、BA-荧光纳米粒子浓度,最终得出嗜水气单胞菌B15的最低检测线为8×10~2cfu/mL。