第一部分 新生大鼠肝细胞的分离、培养与鉴定目的：建立一种简单、高效的新生大鼠肝细胞分离与培养的方法。方法：采用组织块-胶原酶消化法,经多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,待体外培养的肝细胞呈克隆样生长形成细胞集落,应用RT-PCR和Western blot技术分别检测新生大鼠肝细胞中ALB、CK-18、CK-8和AFP的mRNA和蛋白表达情况,同时将同种新生大鼠肝组织、大鼠肝组织中作为参照,进行生物学功能鉴定。结果：分离的新生大鼠肝细胞体外培养,在倒置显微镜下可见细胞形态呈现为圆形,24h部分细胞贴壁,胞体伸展后,呈岛屿状,由圆球形转变为椭圆形,48h细胞进入增殖期,细胞呈不规则多边形上皮细胞特征,3d培养的肝细胞互相连接成片,同时胞体透明度减弱、轮廓增强,可见部分肝细胞呈双核或多核。5d细胞形态基本一致,呈克隆样生长彼此之间相互融合。RT-PCR技术检测新生大鼠肝细胞表达成熟肝细胞标记物ALB、CK-18、CK-8 mRNA:Western blot技术检测新生大鼠肝细胞表达成熟肝细胞标记物ALB、CK-18、CK-8蛋白。结论：成功分离、鉴定出了新生大鼠肝细胞,并可在体外条件下扩增培养。第二部分CaMKⅡγ基因慢病毒的包装、滴定、筛选与鉴定目的：探讨慢病毒系统介导的CaMKⅡγ基因在大鼠肝细胞中过表达和干扰,为进一步研究CaMK Ⅱγ基因在肝脏再生的作用机制奠定基础。方法：根据大鼠CaMKⅡγ基因的nRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ基因,构建过表达载体和过表达空载体,同时设计shRNA干扰序列3对和对照序列1对,构建3个shRNA干扰慢病毒载体和干扰空载体,并转化至感受态Stbl3细胞进行测序验证,继而在脂质体介导下转染293Ta细胞,包装产生慢病毒,并进行滴度测定。分别用不同的慢病毒转染至大鼠肝细胞后,将其分组CON组(未感染细胞组)、LV-CaMKⅡγ组(感染慢病毒过表达载体CaMKⅡγ组)、LV-NC组(感染慢病毒过表达空载体组)、shRNA-1组(感染慢病毒干扰载体CaMKⅡγ-shRNA-1组)、shRNA-2组(感染慢病毒干扰载体CaMKⅡγ-shRNA-2组)、shRNA-3组(感染慢病毒干扰载体CaMKⅡγ-shRNA-3组)、shRNA-NC组.(感染慢病毒干扰空载体组)。应用Western blot 和 RT-PCR技术分别检测各组中CaMKⅡγ的mRNA和蛋白表达情况,进而确定CaMKⅡγγ过表达的有效性和CaMKⅡγ干扰效率较高的1对shRNA的可行性。结果：①成功构建了慢病毒CaMKⅡγ过表达载体、干扰载体,并成功包装慢病毒；②利用RT-PCR分别测定携带CaMKⅡγ过表达载体、CaMKⅡγ,过表达空载体、CaMKⅡγ-shRNA-1载体、CaMKⅡγ-shRNA-2载体、CaMKⅡγ-shRNA-3载体、CaMKⅡγ-shRNA-NC载体的病毒滴度为：386 × 108copies/ml、1.26×108copies/ml .9.54×108copies/ml、8.32×108copies/ml、9.04×108copies/ml、2.28×108copies/ml。③各组慢病毒成功感染大鼠肝细胞；④RT-PCR检测CaMKⅡγmRNA表达的结果：感染48h后,CON、LV-CaMKⅡγ、LV-NC组细胞的CMKⅡγ mRNA相对含量(CaMKⅡγ/GAPDH)分别为1.000、10.679±0.021、0.968±0.010, LV-CaMK Ⅱγ组CaMKⅡγ mRNA的含量与CON、LV-NC组相比明显上调,差异有统计学意义(P<0.001),说明LV-CaMKⅡγ组过表达效果较好；感染48h后,CON、shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-NC组细胞的CaMKⅡγ mRNA相对含量(CaMKⅡγ/GAPDH)分别为000、0.114±0.005、0.457±0.008、0.561±0.006、 1.062±0.007,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3组CaMKⅡγ mRNA的含量与CON、LV-NC组相比明显下调,shRNA-1组干扰效果显著高于shRNA-2组、shRNA-3组,差异有统计学意义(P<0.001),其中shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3组各自的干扰效率为：(85.6±0.5)%、(54.3±0.8)%、(43.9±0.6)%,说明shRNA-1组干扰效果较好。⑤Western b lot检测CaMKⅡγ蛋白表达的半定量结果：感染48h后,稳转CaMKⅡγ基因过表达后的表达为LV- CaMKⅡγ组明显高于CON组和LV-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。感染48h后,稳转CaMKⅡγ基因沉默后的表达为shRNA-1组明显低于CON组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：慢病毒介导的CaMKⅡγ基因过表达技术在大鼠肝细胞中构建成功并实现基因的过表达；干扰慢病毒基因沉默CaMKⅡγ基因在大鼠肝细胞中构建成功并证实目的基因表达量的显著下调,为后续研究CaMKⅡγ基因作为大鼠肝细胞增殖靶向基因,继而过表达和沉默后对肝脏再生的影响作为基础,同时为肝脏再生体外研究提供了可靠的理论依据。组CaMKⅡγ mRNA的含量与CON、LV-NC组相比明显上调,差异有统计学意义(P<0.001),说明LV-CaMKⅡγ组过表达效果较好；感染48h后,CON、shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-NC组细胞的CaMKⅡγ mRNA相对含量(CaMKⅡγ/GAPDH)分别为000、0.114±0.005、0.457±0.008、0.561±0.006、 1.062±0.007,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3组CaMKⅡγ mRNA的含量与CON、LV-NC组相比明显下调,shRNA-1组干扰效果显著高于shRNA-2组、shRNA-3组,差异有统计学意义(P<0.001),其中shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3组各自的干扰效率为：(85.6±0.5)%、(54.3±0.8)%、(43.9±0.6)%,说明shRNA-1组干扰效果较好。⑤Western b lot检测CaMKⅡγ蛋白表达的半定量结果：感染48h后,稳转CaMKⅡγ基因过表达后的表达为LV- CaMKⅡγ组明显高于CON组和LV-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。感染48h后,稳转CaMKⅡγ基因沉默后的表达为shRNA-1组明显低于CON组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：慢病毒介导的CaMKⅡγ基因过表达技术在大鼠肝细胞中构建成功并实现基因的过表达；干扰慢病毒基因沉默CaMKⅡγ基因在大鼠肝细胞中构建成功并证实目的基因表达量的显著下调,为后续研究CaMKⅡγ基因作为大鼠肝细胞增殖靶向基因,继而过表达和沉默后对肝脏再生的影响作为基础,同时为肝脏再生体外研究提供了可靠的理论依据。第三部分Ca2+/CaM/CaMK Ⅱ信号通路在大鼠肝切除后肝再生中的初步研究目的：探讨Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在大鼠肝切除后肝再生中的影响,并进一步通过靶向CaMKⅡ γ基因的慢病毒注射入大鼠体内,再次观察大鼠肝切除后肝再生的变化,初步研究Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路在大鼠肝再生中的变化,为以后研究促进肝脏再生的相关作用机制奠定基础。方法：(1)建立动物模型：切除肝左叶、双尾叶、肝右下叶、肝右上叶,建立稳定的SD大鼠60%肝部分切除模型。(2)实验分组：肝部分切除术后分为5组,A组(生理盐水对照组)、B组(感染慢病毒过表达空载体组)、C组(感染慢病毒过表达载体CaMKⅡγ组)、D组(感染慢病毒干扰空载体组)、E组(感染慢病毒干扰载体CaMKⅡγ-shRNA组),均在术中通过盲肠静脉注射法给药,慢病毒给药剂量为1.0×108TU/只,生理盐水对照组给予等体积500μl生理盐水。各组分别在术后1、3、5和7d四个时间点收集血样和组织标本。(3)相关指标检测：①测定大鼠肝再生指数；②应用全自动生化分析仪检测肝功能指标变化情况；③应用Fluo 4-AM荧光探针标记Ca2+后,并用流式细胞技术检测Ca2+变化情况;④应用RT-PCR技术检测各组中CaM.CaMKⅡγ的mRNA水平；⑤应用 Westernblot技术检测各组中CaM.CaMKⅡγ的蛋白表达情况；⑥应用免疫组织化学技术检测各组中CaM、CaMKⅡY的蛋白表达情况。结果：(1)通过大量的手术操作训练,成功建立稳定的大鼠60%肝部分切除实验模型。(2)各组慢病毒在大鼠体内均成功感染肝细胞。(3)相关指标检测结果：①肝再生指数：各组术后残肝肝体积比随时间变化逐渐增加,术后第1天各组均无明显差别,第3、5天C组明显高于A组(P<0.05),且A组明显高于E组(P<0.05),而A、B、D组无明显差别,术后第7天E组明显小于A组(P<0.05),而A、B、C、D组均无明显差别。②肝功能结果：各组术后ALT、AST水平均于术后第1天达到高峰,并随时间的延长呈下降趋势,有统计学差异(P<0.05),而各时间点及不同组间ALT水平于术后1天C、E组两组均明显高于A组(P<0.05),且C、E两组之间没有明显差别,A、B、D三组之间没有明显差别,术后3、5、7天五组均无明显差别。各组术后TBIL水平均于术后第1天达到高峰,并随时间的延长呈下降趋势,有统计学差异(P<0.05),而各时间点及不同组间TBIL水平于术后1、3、5、7d时各组均无明显差异(P>0.05)。③流式细胞仪检测Ca2+情况：各组术后各时间点及不同组内肝细胞的Ca2+比例的差异具有统计学意义,各组肝细胞中Ca2+比例于术后1d达到最高峰,并随时间延长逐渐下降,7d又逐渐升高。各时间点及不同组间的Ca2+比例于术后第1天各组均无明显差别,第3天E组明显高于A组(P<0.05),且A组明显高于C组(P<0.05),而A、B、D组无明显差别,第5、7天C组明显高于A组(P<0.05),且A组明显高于E组(P<0.05),而A、B、D组无明显差别。④实时荧光定量RT-PCR检测CaM、CaMKⅡmRNA表达结果：各组术后各时间点及不同组内的CaM、CaMKⅡmRNA的差异均具有统计学意义,随时间的推移逐渐的升高。各时间点及不同组间的CaM、CaMKⅡmRNA于术后第1天各组均无明显差别,第3、5、7天C组明显高于A组(P<0.05),且A组明显高于E组(P<0.05),而A、B、D组无明显差别。⑤Western blot检测CaMs、CaMKⅡ的蛋白表达结果：各组术后各时间点及不同组间的CaM、CaMKⅡ蛋白于术后第1天各组均无明显差别,第3、5、7天C组明显高于A组(P<0.05),且A组明显高于E组(P<0.05),而A、B、D组无明显差别。⑥免疫组织化学检测CaM、CaMKⅡ的蛋白表达结果：各组术后各时间点及不同组内的CaM、CaMKⅡ的差异具有统计学意义,随时间的推移阳性染色率逐渐的升高。各时间点及不同组间的CaM、CaMKⅡ比较结果示：术后第1天各组阳性率均无明显差别,第3、5、7天C组阳性染色率最高,A、B、D组次之,E组阳性率染色率最低。C组明显高于A组(P<0.05),且A组明显高于E组(P<0.05),而A、B、D组无明显差别。结论:大鼠肝脏切除术后Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路中在肝脏再生过程中具有一定的调节作用,对肝脏切除术后肝脏再生可能有一定的意义。