光作为植物光合作用的唯一能源是植物生命活动的基础。然而,当植物吸收的光能超过其电子传递所需时,过剩的光能便会造成光合效率和光合功能的降低,引起光抑制,严重时还会发生光氧化破坏。植物除了在强光下会产生光抑制外,在低温弱光、高温、干旱、盐碱等逆境下由于CO2的固定受到限制,使得植物对光能的利用减少而导致光抑制。高等植物体内存在着多种防御机制以避免或减少光抑制,其中叶黄素循环被认为是逆境下保护植物光合机构免受过剩光能破坏的一种重要的机制。叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质（V）在紫黄质脱环氧化酶（VDE）的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质（A）转化为无环氧的玉米黄质（Z）;在暗处,则在玉米黄质环氧化酶（ZE）的作用下朝相反的方向进行,将Z重新环氧化为V,形成一个循环。依赖于叶黄素循环的非光化学猝灭（NPQ）能够保护植物光合机构免受过剩激发能的破坏。有过剩光能存在时,由紫黄质（V）脱环氧化而积累的玉米黄质（Z）也被人们普遍认为对光合机构起到至关重要的保护作用。本研究从番茄叶片中分离到番茄紫黄质脱环氧化酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。结果表明,该基因的表达并受光强、温度和昼夜节律的影响。过量表达该基因可减轻番茄植株对光抑制的敏感性,而抑制该基因表达可加重番茄植株在低温弱光胁迫下的光抑制程度。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到紫黄质脱环氧化酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为LeVDE（FJ648424）。该基因全长为1670bp,ORF为1437bp,编码478个氨基酸,分子量约为53 kDa。同源序列比较发现,番茄紫黄质脱环化酶基因的序列与拟南芥、烟草、菠菜、莴苣、水稻的紫黄质脱环化酶基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明LeVDE有三个特征结构域,block I为-端半胱氨酸富集区,有活性的VDE中N-端含有11-13个半胱氨酸,是VDE的抑制剂DTT作用的区域,低浓度DTT只能部分抑制VDE的活性,说明N-端的半胱氨酸形成不止一个二硫键。block II为脂质运载蛋白特征区,结合和转运疏水小分子的区域,为疏水底物A和Z的结合区。block III是C-端谷氨酸富集区,含有大量的负电荷,是VDE与类囊体膜结合的部位。2. Northern杂交结果表明,LeVDE基因呈非特异性表达,在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时,该基因在弱光和强光处理的24小时昼夜周期中都存在着相似的双峰表达模式,并部分受低温的抑制。Southern杂交结果表明,LeVDE基因在番茄基因组中是单拷贝的。3.将获得的LeVDE基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型植株相比,过量表达LeVDE基因的番茄叶片中A和Z的含量增加,而V的含量减少,脱环氧化状态较野生型高。LeVDE基因表达受到抑制的番茄植株中V量积累,而A和Z含量非常低,脱环氧化状态保持较低的水平4.构建了原核表达载体pET-LeVDE,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1: 500。Western杂交表明,转正义植株中LeVDE基因已在蛋白水平过量表达。另外,分别对低温弱光和强光处理的野生型番茄进行了Western杂交分析。结果表明,LeVDE在蛋白水平的表达始终处在稳定的水平,基本不受光强和温度的影响。5.在低温弱光(4℃,100μmol m^-2 s^-1)和强光(1200μmol m^-2 s^-1)胁迫条件下,野生型和转正义基因株系T1-7和T1-10株系的NPQ及叶黄素循环脱环氧化状态（A+Z）/（V+A+Z）都增加,但野生型的增加更为明显。在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转基因株系比野生型耗散能力加强。强光处理过程中,野生型比转正义基因株系的Fv/Fm降低更明显,且转基因株系的Fv/Fm恢复较快,野生型的Fv/Fm恢复较慢。与在强光下类似,T1-7和T1-10株系的Fv/Fm在低温胁迫过程中降低的程度比野生型小,而恢复较慢。这表明LeVDE的过量表达减轻了PSII的光抑制程度,与转基因番茄相比,野生型的PSII反应中心受伤害较严重。强光胁迫12 h,野生型和转基因番茄的净光合速率降低非常显著,但野生型下降程度明显大于转基因株系。这表明由于LeVDE的过量表达增强了低温弱光和强光胁迫下PSII反应中心的稳定性,使光合机构所受到的伤害减轻。在低温弱光处理过程中转正义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,且野生型降低幅度大于转正义基因植株。经过12 h的处理,T1-7,T1-10和野生型的O₂^-|-含量分别增加了52.3 %,59.8%和81.1 %, H2O2含量分别增加了40.1%,42.3 %和61.3 %。野生型中O2和H2O2含量增加的程度明显高于转基因株系。另外,在低温处理过程中,转正义基因植株和野生型的MDA含量都增加,但转正义基因植株的MDA含量增加的较少。6.抑制LeVDE的表达使得过剩光能胁迫下的NPQ减少。在转反义基因植株中V大量积累而Z和A的含量非常低。在强光和低温弱光胁迫后,转反义基因植株脱环氧化状态始终保持较低的水平。在强光和低温胁迫过程中野生型和转反义基因植株的NPQ都上升,且胁迫12 h后转反义基因植株的NPQ低于野生型。这表明抑制Z的生成使得依赖于叶黄素循环的能量耗散减弱。7.在强光胁迫下野生型和转反义基因植株的Fv/Fm都降低,但是转反义基因植株降低幅度大于野生型。低温弱光胁迫下野生型与转反义基因植株的Fv/Fm均下降,转反义基因植株下降更为明显,低温处理后,（-）2,（-）9和野生型植株的Fv/Fm分别下降了20.1%,17.9%,12.1%。在低温弱光处理过程中转反义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,转反义基因株系植株P700的下降更为显著。低温处理后,（-）2,（-）9和野生型植株中O₂^-|-含量分别增加了79.1%,76.4%和62.7%。经低温弱光处理后,野生型和转反义基因植株中MDA含量都增加,转反义基因植株中MDA含量增加更为显著,低温胁迫12小时后野生型,（-）2和（-）9中MDA含量分别增加到138.5 %,159.1 %和161.7%。综上所述,LeVDE的表达受温度、光强和昼夜节律的影响。过量表达该基因减轻了PSII和PSI对光抑制的敏感性。抑制该基因的表达加重了强光和低温弱光胁迫下的光抑制。