转基因技术(Transgenic technology)是进行基因功能研究和生物遗传改良的重要工具。从20世纪70年代初被建立以来,经过近半个世纪的发展,转基因技术已经日臻成熟。近年来,转基因技术在功能基因组研究、定向遗传育种、建立人类疾病模型和生物反应器开发等方面都发挥了巨大的作用。但转基因技术自诞生之日起,科学界和社会公众对转基因生物(Genetically modified organisms, GMOs)安全性的担忧就一直存在,对转基因生物是否安全的争论也从未停止。目前,人们对转基因生物安全问题的考虑主要包括转基因操作技术安全问题与转基因产品(Genetically modified products, GMPs)安全问题这两个方面。转基因操作技术安全问题主要体现在转入的外源基因是否会对受体动植物生长产生不良影响以及是否会对生态环境造成破坏。转基因产品安全问题则主要体现在转基因食品(主要指农作物)以及利用转基因生物反应器生产的抗体、疫苗等医药制品或经其他基因工程下游技术生产的生物类制品是否会对人类健康造成潜在危害。因此,如何利用并结合不同的遗传操作手段,解决转基因生物中潜在的安全隐患,进而消除公众对转基因生物安全性的担心,已经成为转基因生物新品种培育、推广和产业化开发应用中必须解决的关键问题。家蚕(Bombyx mori)是人工饲养和驯化的重要经济昆虫,利用家蚕生产丝蛋白已有超过5000年的历史。自2000年第一例利用piggyBac转座子实现转基因家蚕建立的报道以来,该转基因技术已经被广泛应用于家蚕基因功能鉴定、生物反应器开发和创制具有特定基因差异的家蚕材料。但利用目前公认最有效的piggyBac转座子建立的转基因家蚕,仍旧存在由于转座子在基因组整合的随机性和不稳定性,以及筛选标记基因在基因组的保留等缺陷所导致的安全问题。家蚕转基因安全问题主要体现在转基因操作技术安全方面,其主要包含以下几个问题：(1)筛选标记基因和转座子骨架序列等非目的基因序列在转基因家蚕基因组的保留所带来的潜在安全隐患：(2)piggyBac转座子随机整合所引起的位置效应和插入突变,会严重影响外源基因的表达,并可能会对转基因个体的生长造成危害；(3)piggyBac转座子介导外源基因在家蚕基因组整合的不稳定现象,可能会导致转基因在传代过程中的丢失或者通过水平转移逃逸至其他生物物种,从而对生态环境造成破坏。此外,利用piggyBac转座子建立的转基因家蚕还会对基因功能研究造成影响,例如保留在基因组中的筛选标记基因或载体骨架序列可能会影响转基因的正常表达,单纯利用piggyBac转座子也无法实现不同外源基因在基因组相同插入位点功能的比较研究。近年来,转基因家蚕安全问题已经成为了阻碍转基因家蚕实现产业化开发和实际大规模应用的关键问题,但是由于目前业内对家蚕转基因安全性问题的研究还显得较为薄弱,上述问题至今仍未得到有效解决。为了有效克服转基因家蚕可能带来的上述生物安全问题,本论文首先建立了基于FLP/FRT位点特异性重组系统的家蚕转基因定点删除技术,利用该技术可实现对转基因家蚕基因组中筛选标记基因的高效、可诱导的定点删除,从而有效克服筛选标记基因的保留所带来的潜在生物安全隐患；随后建立了基于phiC31整合酶介导的盒式交换(phiC31-RMCE)系统的家蚕转基因定点整合技术,利用该技术可实现不同外源基因在转基因家蚕基因组预先建立靶位点的定点整合,从而有效消除转座子随机整合位置效应对外源基因表达的影响；最后联合位点特异性重组系统及改造的复合型piggyBac转座载体,开发了一项通用且有效的转基因在家蚕基因组稳定整合、表达以及可精确替换的策略,并利用该策略成功地建立了一种稳定、可置换型高效转基因家蚕丝腺表达系统。论文获得的主要研究结果如下：1.家蚕转基因定点删除技术的建立通过胚胎显微注射,首先筛选并建立了1个FLP/FRT系统转基因靶品系(Transgenic target strain, TTS)。分子鉴定结果显示,TTS家蚕基因组中含有单拷贝的被FRT位点锚定的A3-EGFP-SV40表达框。通过胚胎显微注射FLP基因mRNA或重组酶瞬时表达载体pSLA3-FLP的方式引入FLP重组酶的表达,在TTS家蚕后代蛾圈中成功筛选到了A3-EGFP-SV40表达框被定点删除的位点特异性重组品系(Site-specific recombination strain, SSRS)家蚕个体。统计结果显示,通过注射mRNA获得含有SSRS家蚕的阳性蛾圈的概率(13.3%)要明显高于注射pSLA3-FLP获得阳性蛾圈的概率(2.38%)。随后同样通过胚胎显微注射,分别筛选并建立了1个利用家蚕肌动蛋白Actin3基因启动子调控FLP重组酶表达(A3-FLP)的重组酶表达辅助品系(H-A-1)和1个利用果蝇hsp70基因启动子调控FLP重组酶表达(Hsp70-FLP)的重组酶表达辅助品系(H-H-1),期望通过将TTS家蚕与H-A-1家蚕杂交的方式,在TTS&H-A-1双转基因家蚕体内引入FLP重组酶的表达,以实现A3-EGFP-SV40表达框住TTS&H-A-1家蚕后代的高效删除；期望通过将TTS家蚕与H-H-1家蚕杂交并进行42℃热激处理(Heat shock treatment, HST)的方式,在TTS&H-H-1双转基因家蚕体内引入FLP重组酶的表达,以实现A3-EGFP-SV40表达框在TTS&H-H-1家蚕后代的可诱导删除。在进行杂交实验之前,首先检查了FLP重组酶在H-A-1和H-H-1家蚕体内的表达情况。RT-PCR和qRT-PCR结果显示,FLP重组酶在H-A-1家蚕的脂肪体、中肠、丝腺、精巢、卵巢和胚胎等组织中均能高效表达；而通过42℃热激处理能够使FLP重组酶在H-H-1家蚕上述各组织中的表达水平显著上调,其中在精巢、卵巢和胚胎中的表达水平上调了58.2%-72.3%。统计分析结果显示,通过有性杂交引入FLP重组酶的方式,在TTS&H-A-1家蚕后代蛾圈中筛选获得含有SSRS家蚕的阳性蛾圈的概率达到了97.01%-100%；经热激处理的TTS&H-H-1家蚕后代蛾圈中的阳性蛾圈概率(32.14%-36.67%)要显著高于未经热激处理的TTS&H-H-1家蚕后代蛾圈中的阳性蛾圈概率(2.63%-6.67%)。随后,分别提取TTS家蚕和SSRS家蚕的基因组进行分子鉴定,鉴定结果显示位点特异性重组事件精确地发生于TTS家蚕基因组2个FRT位点之间,重组反应没有引起任何的突变或染色体结构变异。利用上述研究的策略和方法,可实现对转基因家蚕筛选标记基因的高效、可诱导的定点删除,从而有效地消除筛选标记基因在转基因家蚕基因组的保留对基因功能研究带来的影响及潜在的生物安全隐患。2.家蚕转基因定点整合技术的建立通过胚胎显微注射,首先分别筛选并建立了1个基因组中含有attPlattP位点对的G1代phiC31/att系统转基因靶品系TTS1-P和1个基因组中含有attBlattB位点对的G1代phiC31/att系统转基因靶品系TTS1-B。分子鉴定结果显示,TTS1-P和TTS1-B家蚕基因组中分别含有单拷贝的attPlattP和attBlattB位点对,插入位点分别定位于第20号(常染色体)和第1号(Z染色体)染色体。通过先回交再自交的制种方式,将TTS1-P和TTS1-B家蚕连续培养7代,最终获得了纯合的G8代TTS8-P雄蛾与雌蛾(基因型分别为+A+Ad和+A+A(?),字母“A”表示转基因,下同),以及纯合的G8代TTS8-B雄蛾(ZAZA8)与杂合的G8代TTS8-B雌蛾(ZAW(?)。通过显微注射将phiC31整合酶mRNA或整合酶瞬时表达载体pSLA3-Int以及相应的含有被attB位点或attP位点锚定的3×P3-EGFP表达框的供体质粒(pSl{attB1-3×p3-EGFP-SV40-attB2}或pSL{attp1-3×P3-EGFP-SV40-attp2})导入TTS9-P或TTS9-B家蚕胚胎,在TTSIO蛾圈中筛选获得含有位点特异性整合品系(Site-specific integration strain, SSIS)家蚕(SSIS1-P或SSIS1-B)的阳性蛾圈的概率为3.84%-7.01%。分子鉴定结果显示,3xP3-EGFP表达框在筛选到的所有SSIS1-P和SSIS1-B家蚕中,均是通过RMCE反应整合至基因组靶位点。统计结果显示,转基因蚕染色体上的attPlattP靶位点对和供体质粒上的attBlattB位点对之间的RMCE效率,比转基因蚕染色体上的attBlattB靶位点对和供体质粒上的attPlattP位点对之间的RMCE效率高。荧光筛选和分子检测结果证实,位点特异性整合的转基因在SSIS家蚕后代基因组中能够稳定的遗传和表达。利用本研究建立的phiC31-RMCE系统可介导外源基因在转基因家蚕基因组预先建立的靶位点的定点整合,从而有效克服转座子介导外源基因随机整合位置效应对转基因表达及基因功能研究带来的影响。3. 一种稳定、可置换的安全高效家蚕转基因操作技术的建立构建含有4个转座子臂序列(L1、L2、R1和R2)、转座酶基因表达框(Hsp70-PBase-SV40)、筛选标记基因(3×P3-DsRed和3×P3-EGFP)及被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框的复合型piggyBac转座载体PB-TP。通过显微注射将PB-TP与转座酶表达辅助载体pHA3PIG共同导入非滞育的871品系GO代家蚕受精卵,筛选并建立了4个同时含有3种不同荧光表型(3×P3-DsRed,用R表示；FibH-EGFP,用g表示；3×P3-EGFP,用G表示)的G1代转基因品系TS1-RgG1-TS1-RgG4。分子鉴定结果显示,TS1-RgG1和TS1-RgG2家蚕基因组中均含有单拷贝的4个完整转座子臂结构及被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列,其中TS1-RgG2家蚕茧丝中的外源蛋白表达量最高,纯EGFP蛋白占茧丝总蛋白含量(w／w)的16%以上。将TS1-RgG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的G2代蚕卵分为3组,1“组正常饲养用作对照,剩下2组分别在胚胎发育阶段(2#组)和幼虫发育阶段(3#组)进行42℃热激处理。从成活的G2代蚕蛾中筛选同时含有3种荧光表型的TS2-RgG2转基因蚕蛾,将其与871回交产生G3代蚕卵,在G3代幼虫中筛选仅含有FibH-EGFP荧光表型(g表型)的TS3-g2家蚕个体,并统计含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈的概率。统计结果显示,从2#组和3#组中筛选到含有TS3-g2家蚕的阳性蛾圈的概率分别为16.22%(6／37)和2.22%(1／45),而在未经热激处理的1“组中并没有筛选到含有TS3-g2 家蚕的阳性蛾圈。分子鉴定结果显示,TS3-g2家蚕基因组中保留了完整的被attP位点锚定的FibH-EGFP-LBS表达框序列,而不再含有任何的转座子元件序列。piggyBac转座子的再转座没有引起切除的TTAA位点或attP位点附近的DNA序列发生任何突变或染色体结构变异。为了鉴定创制不含有转座元件的转基因家蚕的最优热激处理条件,将1头含有FibH-EGFP和3×P3-EGFP荧光表型的杂合TS3-gG2雄蛾(基因组中含有Hsp70-PBase-SV40表达框)与3头871雌蛾回交产生3个不同的G4代蛾圈,随后将每个蛾罔中的家蚕分成3组,按照与之前研究相同的条件进行热激处理,并将各组中成活的TS4-gG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生G5代蛾罔,最后筛选并统计G5代蛾圈中含有TS5-g2家蚕(仅具有g表型)的阳性蛾罔的概率。统计分析结果显示,在胚胎发育阶段进行42℃热激处理的实验组中筛选获得含有TS5-g2家蚕的阳性蛾圈的概率最高,达到了70%-80%。该结果证实,在转基因家蚕胚胎发育阶段,利用42℃进行持续且反复多次的热激处理,是实现转座子序列在其后代家蚕基因组中删除的最有效方法。分别筛选杂合的TS4-g2、纯合的TS4-g2以及杂合的TS4-gG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生G5代蛾圈,鉴定并统计各个G5代蛾圈中具有g表型的TS5家蚕的比例。统计分析结果显示,杂合的TS4-g2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的各个G5代蛾圈中含有g表型的TS5家蚕的比例几乎都为50%,与理论值(50%)没有显著性差异；纯合的TS4-g2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的各个G5代蛾圈中含有g表型的TS5家蚕的比例均为100%,与理论值(100%)完全相符；杂合的TS4-gG2蚕蛾与871蚕蛾回交产生的各个G5代蛾圈中含有g表型的TS5家蚕的比例几乎都为50%,同样与理论值(50%)没有显著性差异。此外,利用荧光显微镜观察到EGFP蛋白在TS7-g2家蚕丝腺和茧丝中均能稳定且特异性地高效表达。基因组PCR鉴定结果显示,FibH-EGFP表达框在TS3-g2家蚕后代基因组的整合和遗传具有稳定性。上述所有结果共同证实,无论转基因家蚕体内是否含有转座酶(PBase), FibH-EGFP表达框均能在TS3家蚕后代基因组中稳定遗传,而且EGFP蛋白在TS3家蚕后代体内及茧丝中均能稳定、均一和高效地表达。本研究首先利用复合型piggyBac转座系统筛选并建立能够高效表达外源蛋白的G1代转基因家蚕系,随后通过热激处理的方式诱导PBase在G2代转基因家蚕体内的表达,最终在G3代家蚕中成功筛选到了基因组中仅保留被attP位点锚定的目的基因表达框序列而不含有任何转座子元件序列的转基因个体。利用上述方法不但能够有效消除piggyBac转座子介导外源基因在家蚕基因组整合的不稳定现象和筛选标记基因、转座子骨架序列保留所带来的生物安全隐患,而且还能够利用位于目的基因表达框两端的2个同向排列的attP位点,通过phiC31-RMCE反应实现不同的待研究外源基因在相同整合位点的定点整合,从而有效克服随机整合位置效应对转基因表达和基因功能研究的影响。此外,本研究建立稳定、可置换型高效转基因家蚕表达系统的策略,也同样适用于其他种类鳞翅目昆虫,可应用于提高转基因昆虫生态安全的生物防控研究领域。