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鳞翅目夜蛾科害虫甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）是一类危害极其严重、抗性上升较快的世界性害虫。对其毒力最高的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫晶体蛋白是CrylCa，根据de Maagd等人的研究结果，CrylCa蛋白的结构域（Domain）Ⅲ决定对甜菜夜蛾的特异性，所以从Bt中寻找高毒力的新的杀虫基因，与CrylCa Domain Ⅲ进行替换，构建高效的融合基因，进一步培育转基因作物和构建遗传工程菌，是一条切实可行的害虫防治新途径。 依据上述思路，本文系统研究了Bt中的一类沉默基因—crylI类基因；克隆了对鳞翅目害虫甜菜夜蛾有活性的crylCa和crylCb基因；深入研究了CrylCa蛋白的活性区；用定点诱变和Domain替换等方法分析了Cry1Ca蛋白结构与功能的关系；建立了Bt和E.coli菌株中的cry基因表达系统。这些研究为揭示cry毒蛋白活性、结构与功能关系、各Domain间的相互关系奠定了基础，对于深入研究Bt杀虫基因的功能与表达调控、延缓昆虫抗性、以及转基因抗虫植物的培育和高效工程菌的构建都具有重要意义。1．cry沉默基因的研究 在国际上率先建立了crylI基因的酶切扩增多态性（cleaved amplified polymorphicsequences，CAPS）鉴定体系，对142株Bt菌株进行了鉴定，98株中含有crylI类基因，证明这一基因广泛存在于Bt菌株中，其中68株含有crylIa基因，29株含有crylIb基因，8株含有crylIc基因，没有发现crylId基因，6株含有一种新类型的crylI基因，PCR产物酶切产生了585，571，381，47bp的四个片段，与已知crylI基因产生的片段不一致。首次系统地研究了142株Bt菌株的crylI-cryl类基因的连锁规律，根据cryl基因下游保守区序列和crylI基因上游保守区序列，设计了一对特异性通用引物S5una和S3una，PCR检测，其中71株出现阳性结果，说明了这种连锁普遍分布于Bt菌株。随后克隆了Btc007和J8菌株中的crylI-cryl类基因的连锁序列，完成序列测定，在GenBank中登记，Accessionnumber分别为AF373208、AF373209。序列分析表明，Btc007中是cry1Db和crylI基因连锁，J8中是crylAc和crylIa连锁，在两个基因的间隔区存在多个原核转录终止序列，无启动子，揭示了这两个菌株中crylI基因沉默的原因。 根据上述鉴定结果，从Bt菌株Btc007中克隆了一种新类型的crylI基因。该基因编码分子量为81KDa的蛋白质，由719个氨基酸组成，等电点为pH5.91。进一步确定了5个保守区（conserved block）的位置，Block在186-202、Block 2在253-298、Block 3在491-536、Block 4在557-567、Block 5在634-643氨基酸之间。比较了氨基酸的同源性，发现与己知Cry蛋白的同源性都低于95％。该基因已在GenBank中登记，Accession number为AF211190。Bt毒蛋白基因国际命名委员会已正式命名该基因为crylIel，并确定其为一种新的cry模式基因，这也是我国分离克隆的第一个cry模式基因，在分类上占有重要地位。 摘 公 从Bt菌株Bt。001中克隆了一种新的Crylla基因，被Bt ＄蛋白基因国际命名委员会 命名为 cryllas基因。Accession nubmer为 AF373207，该基因编码的蛋白质由719个氨基 酸组成，等电点为叫．995。 用 pET－Zlb载体分别构建了表达CI’yllel和 Cryllas基因的重组质粒 pETB－IIE和 pB081 IA，导入大肠杆菌 BLZI（DE3）中获得高效表达。这是国内首次用 pET系列的载 体表达 cry基因。表达产物 Cryllel对鳞翅目害虫亚洲玉米螟（Ostrinia firnacalis）和小 菜蛾 （Plutell xylostella）两种试虫具有高毒力：对亚洲玉米螟LC扣为 16．Zlppm，接近对 玉米螟毒力最高的CrylAb基因，对小菜蛾的LC。。为197．88ng／mL；Cryllas对玉米螟和 小菜蛾也表现出高毒力，对玉米螟的 LCS＊于 25PPm，对小菜蛾LCS。为 2227．38figlinL。 但未发现两者对鞘翅目害虫榆兰叶甲（Pyrraha aenescens）有活性。这两种基因的克隆为 玉米螟等鳞翅目害虫的防治提供了新的基因来源。 2．对甜菜夜蛾有活性的Cy基因研究 从 Bt菌株 JS中克隆了一种 Cy1Ca基因，编码 11 89个氨基酸组成的蛋白质，分子量 为 134．7m山等电点为 pH4．745，是弱酸性蛋白质。确定了 CrylCS蛋白 5个保守区的位 置，Block在152－181、BlockZ在225－269、Block3在449－496、Block4在517－527、Block 5在605－6 14氨基酸之间。同源比较发现该蛋白与己知的CrylCa氨基酸序列存在差异， 己为 Bt毒蛋白基因国际命名委员会命名为 CIy1Ca7基因。GenBank的 Accession number 为AYOI 5492。从BtC008中分离了1种cy1Ca基因，序列分析发现与Cry1Ca7完全同源。 从Bt菌株BtC001中分离了一种cy1Cb基因，该cy1Cb基因编码的蛋白质由1176 个氨基酸组成，分子量133ica，等电点为pH4．32。该