虎皮病(Superficial Scald)是梨和苹果果实在低温储藏中后期常见的生理性病害,通常表现为果面出现褐色或黑色的不规则状病斑。虽然对该病的防治研究已有近百年历史,但对其具体致病机制至今尚不清楚。α-法尼烯氧化假说认为该病是由果皮中产生并积累的一种挥发性物质—α-法尼烯(α-farnesene)被氧化成共轭三烯醇类物质(Conjugated Trienols,CTols)后引发。该假说虽然得到研究者的广泛认同,但由于相关研究多集中在生理学角度,无法对该假说给出有力证明。本世纪初α-法尼烯合酶(AFS)的发现及其编码基因的克隆使得利用分子手段验证α-法尼烯氧化假说成为可能:利用基因沉默技术干扰α-法尼烯合成途径中的末端酶—α-法尼烯合酶(AFS),可以在不改变其它代谢物的前提下专一的抑制α-法尼烯的合成,若所结果实虎皮病得到有效抑制,则可为α-法尼烯氧化假说提供有力证明;同时转基因材料也可以在生产中发挥重要价值。在已经得到沉默AFS基因的反义和干扰组培苗基础上,本实验首先分别对经5年继代的组培苗和室外生长多年的转基因植株进行了外源基因的稳定性评价和相关生理指标的测定,然后对木本植物中RNA干扰通过嫁接位点的长距离传递效应进行了探索。最后,采用染色体步移技术得到‘丰产’梨和不同苹果品种中α-法尼烯合酶基因启动子序列,并对虎皮病天然抗性差异与品种间α-法尼烯合酶基因启动子元件的关系进行了初步研究。主要结果如下:(1)对经五年继代保存的转基因组培苗和在室外生长多年的转基因植株分别进行了抗性素抗性筛选和基因组PCR鉴定,结果在两种生长环境下的所有转基因材料均鉴定为阳性,证明无论在继代多年的组培苗中还是在多变的外界环境下生长的植株中,转入的外源基因都能够稳定的整合于基因组中而不发生丢失。(2)采用实时荧光定量PCR技术对一年生、多年生植株以及嫁接后接穗部正常生长的叶片分别进行α-法尼烯合酶基因(PcAFS)转录水平分析,发现反义和干扰株系叶片中PcAFS基因的转录水平明显低于野生型,且沉默效应在一年生和四年生植株中以及嫁接后枝条中均十分类似,证明沉默效应能够长年稳定保持,且不受嫁接的影响。(3)通过对叶片中PcAFS基因的表达进行诱导使其转录水平提高近百倍,达到了与果实中表达水平相当的程度,结果反义和干扰株系中依旧保持显著的抑制效果,表明对PcAFS基因的沉默效应不受靶m RNA表达丰度的影响。(4)进一步在终产物水平对三年生和四年生植株叶片中释放的α-法尼烯含量进行气质联用(GC-MS)分析,结果只有野生型中能检测到α-法尼烯的产生,而反义和干扰株系叶片中α-法尼烯均低于检测下限。证明本实验所构建的反义和干扰株系最终达到了预期的抑制挥发物α-法尼烯释放的目的。(5)测定了各株系萜类合成途径关键酶基因的表达及重要萜类次生代谢物在不同生长时期的含量变化,发现二者在野生型与转基因株系间均不存在明显差异,表明沉默PcAFS基因对其所在途径上游基因的表达及重要萜类物质的代谢平衡没有明显影响。(6)分析了转基因植株对高温和氧化胁迫的抗性,发现其与野生型间没有显著差异;对转基因株系与野生型间株高、叶形、节间长度等生理指标的统计也未发现明显区别,表明抑制α-法尼烯产生并未改变转基因植株的形态特征和其对非生物胁迫的抗性。(7)以野生型枝条作接穗分别嫁接到反义和干扰砧木上,研究了木本植物中是否同草本植物一样存在沉默效应通过嫁接位点的传递现象。结果仅嫁接到干扰砧木上的个别枝条出现了PcAFSA的沉默,表明至少在采用双舌接方式嫁接的接穗中,在其嫁接初期从砧木中获得沉默效应的概率较低。(8)克隆并比较了不同虎皮病抗性品种“青香蕉”和“富士”苹果α-法尼烯合酶基因启动子序列,发现二者序列同源性高达99%,顺式作用元件完全一致,推测其品种间转录水平的差异可能并非由顺式作用元件决定。(9)扩增得到西洋梨PcAFS基因启动子区2007bp序列,与苹果中得到的对应启动子进行同源性比对,发现二者仅有翻译起始密码子上游350bp左右的同源区,同源区外序列则差异较大,总体相似度仅48.31%。(10)统计了西洋梨启动子与苹果启动子中共同存在的顺式作用元件,依据各元件所在位置构建了西洋梨启动子5?端系列删除表达载体并转化烟草,对T1代转基因幼苗进行GUS染色分析,发现即使缩短至226bp的启动子仍然具有激活下游基因转录的功能。