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由淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)引起的淋巴囊肿病主要表现为一种慢性皮肤瘤,通常发生于鱼的体表皮肤、鳍等处。目前,该病在世界范围内己感染了包括海水、淡水和半咸水的42科125种以上的鱼类。自从1992年,我国在养殖的石斑鱼、红鱼中发现淋巴囊肿病以来,受感染的鱼类已有真鲷(Pagrosomus major)、鲈(Lateolabrax japonica)、紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)等10余种。淋巴囊肿病是一种慢性疾病,潜伏期长达几个星期,发病后的鱼体外观丑陋,使之丧失商品价值,从而造成严重的经济损失,制约了海水鱼类养殖业的发展。因此,建立淋巴囊肿病的早期检测和诊断技术对控制该病的发生和蔓延显得尤为重要。 在国家自然科学基金项目的资助下,本文建立了淋巴囊肿病毒的核酸检测诊断技术,并开展了该病流行情况的调查。 取青岛市黄岛某养殖场具典型症状的牙鲆体表囊肿,经匀浆机匀浆、冻融三次、手动匀浆、超声波破碎后,通过差速离心和蔗糖密度梯度离心,在37%～40%和47%～50%的蔗糖界面上有折光带形成。经负染,透射电镜观察后发现37%～40%带中病毒粒子较少,杂质较多;47%～50%带中病毒粒子密度大,基本没有杂质,且病毒完整,直径约为230nm。 病毒粒子经蛋白酶K和SDS消化后,用苯酚/氯仿抽提法提取病毒核酸,产量约为2.30μg/μl。病毒基因组DNA用BanⅡ、BgⅢ、ScaⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HincⅡ和BamHⅠ酶切后,形成的片段数目分别为4、11、10、10、6、17和4。以λDNA/HindⅢ酶切片段和DNA Marker DL2,000作为标准,用Bio-Rad Quantity One软件计算出各酶切片段的分子量,由各酶切片段总和计算出LCDV青岛分离株的基因组DNA大小平均值约为56.0 kb,即Mr约为37.0×10~6 D。病毒DNA经Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ酶切进行的甲基化分析表明,病毒基因组DNA能被对CpG甲基化修饰不敏感的Msp Ⅰ切开,而不能被CpG甲基化修饰敏感的HpaⅡ切开,由此证明LCDV DNA胞嘧啶5’端高度甲基化。 根据LCDV的主要核衣壳蛋白基因序列(GenBank:AF126405),设计了一步PCR和巢式PCR引物。在根据Primer premier 5.0分析获得的引物退火温度基础