I型胶原是纤维化中细胞外基质（ECM）的主要成分之一，其表达受转录、转录后水平多重调控。既往大量的研究多集中在转录后水平，随着分子生物学理论和技术的进展以及对分子调控机理认识的日益深入，仅从蛋白质（转录后）水平研究纤维化形成中I型胶原的过度激活表达机制显然不足以从更深层次的分子水平揭示纤维化、硬化形成机理以及药物作用机制。为此，本研究利用基因重组、细胞基因转染、报告基因测活等技术，从信号传导的终点这一高起点分析细胞因子在纤维化形成中的作用机制及药物干预可能的作用环节。为分子水平阐明纤维化、硬化形成机制及临床合理、有效的选择药物提供实验依据。 第一部分 pCOLH质粒重组体的构建及活性测定 以含人α1（I）前胶原基因-5.3kb～+42bp 的质粒为模板，PCR扩增得到六个具有相同3’端的长短分别为0.1kb、0.27kb、0.5kb、 且0．gkb、1．skb、2．skb的片段分别作为启动子，与不含启动子但含报告基因的载体pCAT3－Enhancer分另组成重组体pCOLHO．1、pCOLHO．27、pCOLHO．5、pCOLHO．9、pCOLHI．5、PCOLHZ．5。这些重组体经酶切鉴定正确，分别相应于人口二 （）前胶原基因上游＊～叶、《～＋42hp、－496～＋42hp、－829～＋42hp、－1448～＋42hp、－2483～＋42hp的序列。用Fugene转染法将各重组体瞬时转染至正常人皮肤成纤维细胞，用ELISA法测定细胞报告基因CAT表达量。以PCOLHZ．5转染细胞后CAT表达量为1，计算出其余重组体转染细胞后的CAT相对表达量。结果表明转染pCOLHO．27、pCOLHZ．5重组体的细胞具有高CAT表达量。按活性强弱依次为：PCOLHZ．5、PCOLHO．27、PCOLHI．5、PCOLHO．9、PCOLH0．5、pCOLHO．ic 该结果提示在人al叮）前胶原基因上游5’侧翼区《．skb序列中存在正性和负性调控元件。正性调控元件可能存在于七483～1448hP、－1448一829hp、－829一498hp、－268一105hp，而负性调控元件则可哺存在于－498一268hp。采用计算机DNASSIS 上1．0软件模拟分析－2484～＋42hP可能存在的核蛋白因子，提示在－10foP有NF一l识别位点、l 有AP叶结合位点、刁 有SP刁结合位点，这些转录因子识别位点可能与－268～＋42hp的高启动活性有关。在－2483～＋42hp这 2．skb的序歹中有 5个 SP一1、1个 NF K B、2个 AP一l核蛋白结合位点，其中SPl、APl可能与该段序列的高启动活性有关。 应用本研究中构建的6个重组体，还能对致／抗纤维化相关因子的作用机制进行转录水平的探讨，进一步研究相应于这些高启动活性序列的DNA结合蛋白，在激活态胶原产生细胞中发现纤维化相关的新的或特异核转录因子。这一研究将有助于我们进一步认识纤维化（硬化） 2 发生中胶原基因如何被转录激活，为纤维化的逆转提供新思路。此外， 本研究中建立的含有效口！O）前胶原基因启动序列的重组体，由于 报告基因检测方法简便且能定量，是一个新的转录水平筛选抗纤维化 药物的可靠方法。 第二部分 细胞因子及药物对肾小球系膜细胞增殖的影响 本文选择参与肾小球硬化形成的重要细胞因子血小板源生长因子 卯DGF）作为刺激因子来研究O）某些药物能否直接抑制系膜细胞增 殖；（2）能否桔抗 PDGF诱导的细胞增殖作用。用 BrdU掺入法和 MTT 法测定 PDGF、血管紧张素＊ u 11人及药物洛沙坦、维拉帕米、地 塞米松对大鼠系膜细胞增殖的影响，得到以下结果： 1、细胞因子及Aug 11对系膜细胞增殖的影响 PDGF在10～ 50ng加 的浓度范围内，剂量依赖性地促进大鼠系膜细胞的生长沪wt 0．01人各浓度的 Aug 11亦有促进系膜细胞增殖活性吓．of人 2、药物对系膜细胞增殖的影响 血管紧张素＊ I型受体“TI） 阻滞剂一洛沙坦、钙离子桔抗剂一维拉帕米和糖皮质激素类药物一地 塞米松对系膜细胞的增殖亦有抑制作用O＜0．01人 药物浓度增加抑 制率随之增强。洛沙坦与维拉帕米联合使用对系膜细胞的抑制作用较 单独使用洛沙坦吓＜0．01）或维拉帕米卯．05）明显增强。 3、药物对PDGF诱导的大鼠系膜细胞增殖的作用 洛沙坦、维拉 帕米、地塞米松分别加 PDGF组与单纯PDGF组比较对大鼠系膜细胞的 增殖作用有显著性差异卯．01L 加大各药物剂量其抗增殖活性更 为增强u．01人