研究背景与研究目的:扩张型心肌病(DCM)是世界范围内最常见的心肌病,主要表现为心室腔扩张以及心肌收缩力减弱,临床上扩张型心肌病患者常发生进行性充血性心力衰竭、血栓栓塞以及心律失常等并发症,死亡率高,然而目前尚无十分有效的防治方法。DCM可能由包括缺血损伤以及家族遗传缺陷等多方面的原因引起,然而,在大多数情况下,DCM的发病原因仍然是未知的,并且其潜在的调节途径仍不明确。哺乳动物的Hippo信号通路是一条进化上相对保守的信号通路,TEAD1是Hippo信号通路下游的转录因子,当与转录共激活因子结合,可形成的不同复合物,调节对于胚胎发育,心脏、肌肉等器官形成至关重要的基因的表达。现有文献资料表明,Tead1及其上游调节因子在胚胎和围产期的心肌细胞增殖中起关键作用,而最近的研究也证明哺乳动物Hippo-Tead1信号通路在损伤后心肌细胞再生中的作用。然而,TEAD1在成年心脏中的作用及其具体的作用机制目前并不明确,本文旨在探索TEAD1在成年小鼠心脏中的作用以及相关机制,从而为相关心脏疾病的预防与治疗提供新的作用靶点与研究思路。实验方法:TEAD1在成年小鼠中全身性与心肌细胞特异性诱导性敲除表型分析与细胞水平机制研究(第一部分,第二部分):1)通过CAGG Cre-ERTM+小鼠与TEAD1F/F小鼠杂交获得CAGG Cre-ERTM+/TEAD1F/F小鼠;通过a MHCMer Cre Mer+小鼠与TEAD1F/F小鼠杂交获得a MHC-Mer Cre Mer+/TEAD1F/F小鼠;2)选用8-12周龄的基因型为CAGG Cre-ERTM+/TEAD1F/F成年小鼠,通过连续5天腹腔注射TAM(每千克体重小鼠每天给药25mg)的方式诱导TEAD1基因的全身性敲除;选用8-12周龄的基因型为a MHC-Mer Cre Mer+/TEAD1F/F小鼠,通过连续5天腹腔注射TAM(每千克体重小鼠每天给药25mg)的方式诱导TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除;3)Vevo770高分辨率心脏超声仪检测对照组与TEAD1基因敲除组小鼠心室壁的厚度、心室腔内径与心功能的变化;4)测量各组小鼠各组织器官重量以及胫骨长度,分析各组织器官重量与胫骨长度比差异;5)收取各组小鼠心脏,固定,石蜡包埋,8μm切片后,采用HE染色方法检查小鼠心脏结构变化,采用Masson染色法检测心肌组织的纤维化程度;6)收取各组小鼠心脏,固定,OCT包埋,7μm切片后,采用免疫荧光分析检测小鼠心脏组织的MAC2表达,EBD染色检查小鼠心肌细胞膜完整性,TUNEL染色检测小鼠心肌细胞凋亡情况;7)实时定量PCR方法检测心衰标志物与炎症标志物的m RNA转录水平差异;8)western blotting检测心衰标记物、炎症标记物以及细胞死亡通路相关蛋白的表达变化。TEAD1在成年小鼠心肌细胞敲除导致心肌细胞坏死的分子水平机制研究(第三部分):1)选用8-12周龄的成年a MHC-Mer Cre Mer+/TEAD1F/F小鼠,通过连续5天腹腔注射TAM(每千克体重小鼠每天给药25mg)的方式诱导TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除;2)收取心肌细胞特异性TEAD1敲除小鼠与对照组小鼠的心肌组织,提取RNA,送RNA测序,鉴定出TEAD1可能靶向作用的基因;3)收取心肌细胞特异性TEAD1敲除小鼠与对照组小鼠的心肌组织,进行Chip-assay分析,鉴定出与TEAD1蛋白相结合的目的基因DNA片段;4)western blotting检测成年小鼠心肌细胞TEAD1敲除对Ndufa5与Ndufab1蛋白表达的影响;5)实时定量PCR检测成年小鼠心肌细胞TEAD1敲除对Ndufa5与Ndufab1的m RNA水平影响;6)10T1/2细胞进行双荧光素酶启动子活性分析,检测TEAD1对Ndufa5与Ndufab1转录活性的影响;7)收取心肌细胞特异性敲除小鼠与对照组小鼠的心肌组织,检测线粒体复合体I酶活性;8)收取心肌细胞特异性敲除小鼠与对照组小鼠的心肌组织,提取心肌细胞线粒体,seahorse检测心肌细胞线粒体呼吸功能;9)提取成年小鼠原代心肌细胞,体外培养,4OH-TAM处理,western blotting检测TEAD1基因敲除情况;10)对体外培养的心肌细胞分别进行PI染色检测细胞坏死情况,TMRM染色检测线粒体膜完整性、mito SOX染色检测线粒体过氧化物的产生;验证Nec-1腹腔注射能否缓解TEAD1心肌细胞敲除鼠心衰表型(第四部分):1)TNFa与Nec-1处理L929细胞,通过检测细胞培养上清液LDH验证Nec-1可否正常工作。2)选用8-12周龄的成年a MHC-Mer Cre Mer+/TEAD1F/F小鼠,通过连续5天腹腔注射TAM(每千克体重小鼠每天给药25mg)的方式诱导TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除;Nec-1处理组同时腹腔注射Nec-1 15天,control组腹腔注射PBS 15天。3)Vevo770高分辨率心脏超声仪检测小鼠心室壁的厚度、心室腔内径与心功能的变化;4)测量小鼠心脏重量和体重以及胫骨长度,分析小鼠心脏重量与胫骨长度比差异;5)Masson三色染色法检测心脏组织的纤维化程度;6)收取小鼠心脏固定,OCT包埋,7μm切片后,采用免疫荧光分析检测小鼠心脏组织的MAC2表达,EBD染色检查小鼠心肌细胞膜完整性;7)western blotting检测细胞死亡通路相关蛋白的表达变化;实验结果:第一部分:成年小鼠中TEAD1基因的全身性敲除导致急性扩张性心肌病与严重的心力衰竭表型,细胞水平机制研究表明TEAD1在成年小鼠中的全身性敲除导致小鼠心肌细胞程序性坏死1)通过对基因型为CAGG Cre-ERTM+/TEAD1F/F的小鼠连续5天腹腔注射tamoxifen的方式可成功诱导TEAD1基因的全身性敲除,tamoxifen腹腔注射Control组小鼠不影响全身组织TEAD1的表达。2)小鼠不同时间的心脏超声检查结果显示,TEAD1基因的全身性敲除可导致小鼠心室腔扩大,心室壁变薄,心功能减退,这些指标随时间变化进行性加重,而Control组小鼠的心脏超声检查结果均在正常范围,不随时间变化。3)小鼠生存曲线分析表明,腹腔注射tamoxifen诱导TEAD1基因的全身性敲除后,小鼠在27天内全部死亡,而Control组小鼠可正常存活。4)组织学分析,TEAD1基因全身性敲除鼠心室壁变薄,心室腔增大,Masson三色染色显示小鼠心室肌组织大量的胶原纤维沉积,说明小鼠的心室重构,而Control组小鼠心脏组织结构无明显异常。5)免疫荧光分析结果显示:TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中TUNEL阳性心肌细胞数与Control组相比无明显差异,均在极低水平;TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中EBD阳性心肌细胞数明显高于Control组,差异有统计学意义;TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中MAC2阳性心肌细胞数明显高于Control组,差异有统计学意义;6)RT-q PCR结果表明:TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中心衰标志物ACTA1、CTGF、ANP、MYH7表达上调,MYH6表达下调;炎症标志物MAC2、CD68、IL-6表达上调;7)western blotting结果显示:TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中心衰标志物CTGF表达上调;炎症标志物MAC2、CD45表达上调;程序性坏死通路中的RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL、PGAM5均表达上调。第二部分:成年小鼠中TEAD1基因的心肌细胞特异性诱导性敲除导致急性扩张性心肌病与严重的心力衰竭表型,细胞水平机制研究表明TEAD1在成年小鼠中的心肌细胞特异性敲除导致小鼠心肌细胞程序性坏死1)通过对基因型为a MHC-Mer Cre Mer+/TEAD1F/F的小鼠连续5天腹腔注射tamoxifen的方式可成功诱导TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除,tamoxifen腹腔注射Control组小鼠不影响心肌组织TEAD1的表达。2)小鼠不同时间的心脏超声检查结果显示,TEAD1基因心肌细胞特异性敲除可导致小鼠心室腔扩大,心室壁变薄,心功能减退,这些指标随时间变化进行性加重,而Control组小鼠的心脏超声检查结果均在正常范围,不随时间变化。3)小鼠生存曲线分析表明,腹腔注射tamoxifen诱导TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除后,小鼠可在25天内全部死亡,而Control组小鼠可正常存活。4)组织学分析,TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠心室壁变薄,心室腔增大,Masson三色染色显示小鼠心室肌组织大量的胶原纤维沉积,说明小鼠的心室重构,而Control组小鼠心脏组织结构无明显异常。5)免疫荧光分析结果显示:TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠心肌组织中TUNEL阳性心肌细胞数与Control组相比无明显差异,均在极低水平;TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中EBD阳性心肌细胞数明显高于Control组,差异有统计学意义;TEAD1基因全身性敲除鼠心肌组织中MAC2阳性心肌细胞数明显高于Control组,差异有统计学意义;6)RT-q PCR结果表明:TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠心肌组织中心衰标志物ACTA1、CTGF、ANP表达上调,MYH6表达下调;炎症标志物MAC2、CD68、IL-6表达上调;7)western blotting结果显示:TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠心肌组织中心衰标志物CTGF表达上调;炎症标志物MAC2、CD45表达上调;程序性坏死通路中的RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL、PGAM5均表达上调。第三部分:成年小鼠中TEAD1基因的心肌细胞特异性诱导性敲除通过引起小鼠心肌细胞线粒体功能障碍而导致心肌细胞程序性坏死,分子机制研究表明,TEAD1基因敲除可通过影响心肌细胞线粒体复合体I辅助亚基Ndufa5与Ndufab1表达而干扰线粒体复合体体I与超级复合体的组装,从而导致线粒体电子传递链功能障碍1)RNA-Seq分析表明:TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠的心肌组织中大量的线粒体相关基因表达下调,其中包括线粒体复合体I辅助亚基Ndufa5与Ndufab1。2)CHIP-assay结果表明:转录因子TEAD1可与线粒体复合体I辅助亚基Ndufa5与Ndufab1结合。3)TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠的心肌组织q RT-PCR与western blotting结果显示:心肌细胞TEAD1基因的敲除导致Ndufa5与Ndufab1在m RNA与蛋白水平的下降。4)dual luciferase reporter assay结果表明,转录因子TEAD1可调节Ndufa5与Ndufab1的转录活性。5)Seahorse XF24分析结果显示:TEAD1基因的心肌细胞特异性敲除鼠的心肌细胞线粒体呼吸功能障碍与电子传递链功能障碍。6)线粒体复合体I酶活性分析结果显示:与Control组相比,TEAD1基因心肌细胞特异性敲除鼠的心肌细胞线粒体电子复合体I酶活性明显降低。7)体外培养成年小鼠原代心肌细胞,结果显示:TEAD1基因敲除组心肌细胞的PI阳性细胞率明显高于Control组,TMRM阳性细胞率明显低于Control组,mito SOX阳性细胞率明显高于Control组。第四部分:Nec-1通过抑制程序性坏死信号通路缓解TEAD1心肌细胞敲除鼠心肌衰竭表型1)L929细胞实验证实Nec-1可抑制细胞死亡。2)小鼠心脏超声检查结果显示,与PBS处理的TEAD1ic KO组小鼠相比,Nec-1处理的的TEAD1ic KO小鼠的心室腔扩大程度、心室壁变薄程度明显减轻,心功能明显改善。3)Masson三色染色显示,与腹腔注射PBS的TEAD1ic KO组小鼠相比,腹腔注射Nec-1的TEAD1ic KO小鼠心室肌组织的胶原纤维沉积明显减少。4)免疫荧光分析结果显示:与腹腔注射PBS的TEAD1ic KO组小鼠相比,腹腔注射Nec-1的TEAD1ic KO小鼠心肌组织中EBD阳性心肌细胞数明显降低,差异有统计学意义;腹腔注射Nec-1的TEAD1ic KO小鼠心肌组织中MAC2阳性心肌细胞数明显降低,差异有统计学意义。5)western blotting结果显示:TEAD1ic KO小鼠腹腔注射Nec-1可明显下调程序性坏死通路中的p-RIP3、RIP3、RIP1、MLKL的蛋白表达水平。结论:1.成年小鼠中TEAD1基因的全身性敲除导致小鼠心肌细胞程序性坏死发生,心肌细胞的丢失导致小鼠急性扩张性心肌病与严重的心力衰竭。2.成年小鼠中TEAD1基因在心肌细胞敲除导致小鼠心肌细胞程序性坏死发生,心肌细胞的丢失导致小鼠急性扩张性心肌病与严重的心力衰竭。3.成年小鼠心肌细胞TEAD1基因敲除通过影响线粒体复合体I辅助亚基Ndufa5与Ndufab1转录而干扰线粒体复合体体I与超级复合体的组装,从而导致线粒体电子传递链功能障碍,最终导致心肌细胞程序性坏死的发生。4.Nec-1通过抑制程序性坏死信号通路部分缓解TEAD1基因心肌细胞敲除鼠扩张性心肌病与心力衰竭。