研究背景　　 以靶向性和效应都非常明确的药物,即心肌细胞β1-肾上腺素能受体(β1-adrenergic receptor,β1-AR)激动剂一盐酸多巴酚丁胺(DobutamineHydrochloride,DH)为探针,观察针刺大鼠内关穴对DH的增效作用,并在此基础上通过对血药浓度和靶器官药物浓度的比较分析,以及对穴位针刺后靶器官受体后信号转导通路上一系列信号成分及其对选择性药物反应性的检测,分析靶器官受体信号转导通路上哪个或哪些信号成分参与介导了针刺对DH的增效作用,从而系统阐明穴位针刺对药物增效作用的受体后机制。　　 方法：　　 一、针药结合增效作用的观察确定　　 实验用清洁级健康雄性SD大鼠120只,随机分为正常对照(NC)组、常规静脉注射(intravenous injection,Ⅳ)组、常规肌肉注射(intramuscular injection,IM)组和电针内关穴+穴位注射(EA-IN)组,各组动物在记录10 min正常对照数据后,再分别以不同的方式进行给药。Ⅳ组注射部位为右侧股静脉；IM组注射部位为右后肢臀部肌肉丰厚处；EA-IN组在电针双侧“内关”穴10 min后,穴位注射DH。分别观察比较同剂量的DH在上述不同途径给药及干预下左心室内压(LVSP)、左室压力上升最大变化速率(+dp/dtmax)、心率(HR)的变化,以确定穴位针刺对DH的增效作用。　　 二、不同途径给药后血药浓度的比较研究　　 采用液质联用技术(LC-MS/MS)观察比较在上述不同途径给予相同剂量DH后2、5、15 min三个时间点的血药浓度的差异,以判断血药浓度的改变是否是穴位针刺特异性增效作用的机制之一。　　 三、不同途径给药后靶器官药物浓度的比较研究　　 采用LC—MS/MS观察比较在上述不同途径给予相同剂量DH后2、5、15 min三个时间点时在靶器官-心肌组织中的该药物浓度差异,以判断增加药物靶器官浓度是否是穴位针刺特异性增效作用的机制之一。　　 四、心肌细胞β1-AR信号转导途径在针药结合增效中的作用分析　　 在第一部分工作证明EA-IN组增强心脏功能的效应优于常规肌肉注射的基础上,设正常对照(NC)组、电针内关(EA)组,观察比较心肌细胞β1-AR的数量及其反应性、Gs-蛋白含量、腺苷酸环化酶(AC)的反应性、cAMP含量、蛋白激酶A(PKA)的反应性、L-型Ca2+通道的反应性,来分析靶器官受体信号转导通路上哪个或哪些信号成分参与介导了不同穴位针刺引起的特异性药物的增效作用。具体实验方法如下:　　 a.采用免疫印迹法(Western Blotting)观察比较心肌细胞β1-AR的含量,并以荧光染料Fura-2为钙标记,测量单个心肌细胞内钙对β1-AR激动剂DH的反应性,以探讨穴位针刺是否通过改变其特异性靶器官-心脏β1-AR的数量或反应性,进而达到对DH的特异性增效作用；　　 b.采用Western Blotting方法测定心肌细胞Gs-蛋白含量,以探讨不同穴位针刺是否通过改变β1-AR后信号成分-Gs-蛋白,进而达到对DH的特异性增效作用；　　 c.以荧光染料Fura-2为钙标记,测量单个心肌细胞内钙对AC激动剂Forskolin的反应性,以探讨不同穴位针刺是否通过改变β1-AR后信号成分-AC,进而达到对DH的增效作用；　　 d.采用ELISA法测定心肌cAMP含量,以探讨不同穴位针刺是否通过改变β1-AR后信号成分-cAMP,进而达到对DH的增效作用；　　 e.以荧光染料Fura-2为钙标记,测量单个心肌细胞内钙对PKA激动剂DB—cAMP的反应性,以探讨不同穴位针刺是否通过改变β1-AR后信号成分-PKA,进而达到对DH的增效作用；　　 f.以荧光染料Fura-2为钙标记,测量单个心肌细胞内钙对钙通道激动剂-Bay—K8644的反应性,以探讨不同穴位针刺是否通过改变β1-AR后信号成分-钙通道,进而达到对DH的增效作用。　　 结果：　　 一、药理效应　　 以LVSP、+dp/dtmax、HR为检测指标,经不同途径给予DH后观察到:2min时EA-IN组和IV组药理作用相当(P>0.05),但EA-IN组比Ⅳ组维持时间长(P<0.01),尤其5 min时EA-IN组的作用明显强于其他各组,给药15 min时EA-IN组的作用强度与IM组相当(P>0.05),且强于Ⅳ组(P<0.01)。　　 二、血药浓度　　 注射DH后2 min时,Ⅳ组血药浓度增加最为明显,EA-IN组血药浓度虽低于Ⅳ组(P<0.01),但明显高于IM组(P<0.01)。在注射后5 min时,Ⅳ组血药浓度下降至2 min时的一半,而EA-IN组血药浓度与2min时血药浓度相仿,且高于同时间点IM组的血药浓度(P<0.01)。在注射后15 min时,Ⅳ组血中DH基本上代谢完毕,而EA-IN组血药浓度仍维持在较高水平,且明显高于同时间点IM组血药浓度的水平(P<0.05)。　　 三、靶器官-心肌组织药物浓度　　 注射DH后2 min时,各组动物心肌组织中的药物浓度均有不同程度的增加,其中以Ⅳ组和EA-IN组增加最为明显,且明显高于IM组(P均<0.01)。在注射后5 min时,Ⅳ组心肌组织中的药物浓度迅速下降,而EA—IN组心肌组织中的药物浓度与2 min时相比继续升高,并高于Ⅳ组和IM组(P<0.01,P<0.05)。在注射后15 min时,EA-IN组和IM组的心肌组织中的药物浓度基本仍维持在同一较高水平(P>0.05),IM组高于Ⅳ组相应时间点心肌组织中的药物浓度(P<0.05)。　　 四、β1-AR后信号转导途径分析　　 电针内关穴后,其心肌细胞膜上β1-AR蛋白水平有增高趋势,且EA组大鼠分离的单个心肌细胞在DH作用下钙瞬变的波幅与NC组单个心肌细胞在DH作用下钙瞬变的波幅比较亦有增加的趋势,但两组β1-AR相关指标的差别无统计学意义；　　 电针后心肌细胞膜上Gsα蛋白水平与NC组心肌细胞膜Gsα蛋白水平相比有增高趋势,但两组差别无统计学意义；　　 EA组大鼠分离的单个心肌细胞在Forskolin作用下钙瞬变的波幅与NC组单个心肌细胞在Forskolin作用下钙瞬变的波幅比较增加的幅度明显升高(P<0.05),提示电针内关穴增强了心肌细胞对AC激动剂Forskolin的反应性；　　 EA组大鼠心肌组织cAMP含量与NC组大鼠心肌组织cAMP含量比较有增加的趋势,但两组差别无统计学意义；　　 EA组大鼠分离的单个心肌细胞在DB-cAMP作用下钙瞬变的波幅与NC组单个心肌细胞在DB-cAMP作用下钙瞬变的波幅比较有增加的趋势,但两组差别无统计学意义；　　 EA组大鼠分离的单个心肌细胞在Bay K-8644作用下钙瞬变的波幅与NC组单个心肌细胞在Bay K-8644作用下钙瞬变的波幅比较亦有增加的趋势,但两组差别无统计学意义。　　 结论：　　 上述结果表明,针刺内关对DH确有增效作用,其机制可能涉及以下三个方面:①针刺穴位能够通过影响DH的血药浓度,从而增加其药理作用；②穴位针刺可能通过增加心脏对DH吸收从而增加其药理作用；③针刺内关还可通过增强心肌细胞β1-AR信号转导通路的信号分子AC的反应性,从而增加靶向性药物的药理作用。本工作首次系统探讨了内关穴针刺对正性肌力作用药物的增效作用及其机制；研究结果为穴位注射等针药结合疗法的临床应用提供了令人信服的科学依据。