溶菌酶(Lysozyme, EC3.2.1.17),是一种碱性蛋白酶,专门作用于细菌的细胞壁,使细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4糖苷键断裂,导致细菌细胞发生裂解,产生溶菌现象,从而起到杀死细菌的作用。它广泛存在于动植物和微生物的组织、体液及分泌物中,在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。根据分析海参i型溶菌酶基因结构,发现其完整基因中含有糖苷酶和异构肽活性,而研究推测海参溶菌酶的异构肽活性可能存在于海参溶菌酶C端区域。但利用基因工程手段将海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母系统中表达的文献还未曾出现,这对于海参i型溶菌酶的应用发展很不利,因此本研究旨在构建并筛选出具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(SjLys)和C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌。本研究根据实验室已构建好的pMD18-T-SjLys-C质粒,设计特异性引物,扩增出带有EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。同时,根据实验室已构建成功的海参溶菌酶全长片段表达质粒pPIC9K-SjLys,将其和C端片段重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,利用MM与MD培养基筛选出表型为His+Muts的菌株,再经1%甲醇诱导表达目的蛋白。结果显示,共筛选出6株具有抑菌活性的高拷贝重组海参溶菌酶基因工程菌和4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,重组海参溶菌酶和C端多肽酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,目的蛋白表达量最高,并且具有广谱杀菌作用,即对常见的革兰氏阳性革兰氏阴性指示菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。本研究成功将海参溶菌酶及其C端多肽在毕赤酵母中得到表达,研究为进一步研究海参溶菌酶结构与功能及其C端多肽在真核系统中的表达奠定了基础,也为今后的大规模的工业化生产提供了依据。