论文部分内容阅读
目的金黄色葡萄球菌是引起人和动物化脓性感染的重要病原体，可引起局部化脓感染，也可引起败血症、脓毒血症等全身感染。抗生素的频繁使用加剧了金黄色葡萄球菌耐药现象尤其是多重耐药，现有抗生素已经不足以治愈金黄色葡萄球菌引起的感染，寻找新型抗菌药物成为研究热点。金黄色葡萄球菌的自溶素(AtlA)是一个双功能蛋白，经过蛋白酶作用可分解为51kD的氨基葡萄糖苷酶（glucosaminidase，AtlG）和62kD的酰胺酶（amidase，AtlM）。本研究通过基因工程技术获取金黄色葡萄球菌（ATCC25923）自溶素（autolysin，Atl）的两个功能片段AtlM和AtlG重组蛋白，并初步探讨其在体内、体外的抗菌作用，为自溶素作为抗菌药物的深入研究奠定基础。方法1.获取rAtlM和rAtlG：根据GenBank中金黄色葡萄球菌自溶素的基因序列（AC:D17366）设计合成两对特异的引物，采用PCR技术以ATCC25923的基因组为模板扩增相应的atlM、atlG序列，分别构建克隆质粒及表达质粒；经由IPTG诱导表达重组蛋白rAtlM、rAtlG，通过透析袋电洗脱的方法纯化并测定其浓度。2.体外抑菌试验：采用微量肉汤稀释法测定rAtlM和rAtlG对标准菌株/耐药菌株的MIC。用0.01MPBS（pH7.0）混悬金黄色葡萄球菌（终浓度为5×105CFU/ml）,并加入rAtlM/rAtlG(终浓度为50μg/ml)，测定1h、3h、5h时间点rAtlM及rAtlG对细菌生长的抑制作用及差异。3.体内（小鼠）抑菌试验：以金黄色葡萄球菌标准株及苯唑西林耐药株分别对小鼠行腹腔接种（菌液浓度107CFU/ml，接种0.5ml），1h后再依次给每组小鼠尾静脉注射rAtlM或rAtlG0.2ml(蛋白量1mg/只)，对照组接种0.2ml无菌N.S。2h和4h后每只小鼠眼球采血10μl加入血培养瓶，最终以平板菌落计数测定金黄色葡萄球菌及其耐药株对rAtlM及rAtlG的药物敏感性，判断比较重组蛋白AtlM和AtlG的抗菌活性。结果1.成功构建了原核表达载体pET-32а(+)/atlM和pET-32а(+)/atlG，表达的重组蛋白AtlM、AtlG经过SDS-PAGE电泳鉴定符合预期结果，约为80kD和66kD，经微量紫外分光光度计测得浓度为1.25mg/ml和1.63mg/ml。2.rAtlM对金黄色葡萄球菌及其耐药株的MIC分别为16μg/ml和64μg/ml；rAtlG对金黄色葡萄球菌及其耐药株的MIC分别为8μg/ml和64μg/ml。体外抑菌试验显示，rAtlM、rAtlG对金黄色葡萄球菌及其苯唑西林耐药株均有一定的抑菌作用（3h测定点rAtlM作用于标准株和耐药株的p值分别为0.004，0.001；3h测定点rAtlG作用于标准株和耐药株的p值分别为0.004、0.003）；3h和5h测定点，rAtlM对耐药株的抑菌效果优于rAtlG（p值分别为0.001、0.000）。3.体内溶菌试验初步表明，注射rAtlM或rAtlG的小鼠体内金黄色葡萄球菌及其耐药株数量显著低于对照组(2h时rAtlM作用于标准株和耐药株的p值分别为0.008，0.014；2h时rAtlG作用于标准株和耐药株的p值分别为0.011、0.026)。结论rAtlM和rAtlG对金黄色葡萄球菌及其苯唑西林耐药株均有一定的抑菌作用，具有作为抗菌药物的可能性。