糖尿病是由多种病因引起以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，在发达国家中它是继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染病，已经成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。胰岛素是由51个氨基酸组成的多肽，有A、B两链，两链之间由两个二硫键连接(A7-B7,A20-B19)，其作为治疗糖尿病的特效药物是通过与胰岛素受体的结合来发挥复杂的生物学功能的。从进化过程来看，各种动物的胰岛素结构大体相似，差不多有一半的氨基酸残基的排列顺序保持不变，只是在某些氨基酸组成和排列上有不同程度的差异。比如，六个半胱氨酸残基在两条肽链上的位置不变，这是维持胰岛素独特空间结构的关键。而比较人胰岛素与猪胰岛素，两者仅有一个氨基酸之差，比较牛胰岛素与人胰岛素也只差三个氨基酸。故一些携带重要氨基酸或者能够形成类似空间构象的小肽或许具有类胰岛素的活性。 本研究旨在通过噬菌体展示技术，筛选随机九肽文库(C7C)，寻找能与靶分子特异性结合的噬菌体，测序获得小肽序列，并合成相应的短肽，进一步研究这些短肽的生物学活性。若能够找到合适的短肽代替胰岛素发挥其生物学功能，这为研制类胰岛素的新型肽类药物奠定了一定的基础，对研究胰岛素与其受体结合的作用位点也有一定意义。 一、筛选胰岛素相关肽1.噬菌体展示肽库的亲和筛选以胰岛素多克隆抗体为靶标，对噬菌体展示随机环肽库(C7C)进行亲和筛选。在筛选过程中，通过加大洗板的TBST浓度等方法，去除非结合和弱结合的噬菌体克隆，用酸洗脱法获得能与靶分子特异性结合的噬菌体克隆。三轮筛选后，能与靶分子特异性结合的噬菌体得到了高度的富集。 2.ELISA法挑取噬菌体阳性克隆随机挑取25个经三轮筛选后的噬菌体克隆，制备噬菌体单克隆扩增液，用ELISA法分析它们对靶分子的结合能力。结果显示有15个阳性克隆与靶分子结合能力较强，而且结合率都比九肽原始文库高，其中显示对靶蛋白有高亲和力(A450nm＞0.5)的克隆有5个。 3.胰岛素相关肽氨基酸序列分析对挑取的结合能力强的15个阳性噬菌体克隆进行噬菌体DNA测序，以此确定氨基酸序列，测序引物为5-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3。结果8个克隆携带的环肽为CPTSQANSC(ZJ1)，7个克隆携带的环肽为CVQPSHSSC(ZJ2)。这两个环肽均与胰岛素的氨基酸序列无同源性。 二、模拟胰岛素噬菌体展示肽生物学活性1.胰岛素相关肽的合成根据DNA序列推导出来的小肽序列，由杭州中肽生化有限公司合成小肽。合成小肽的纯度要求≥85％，用于进一步的实验研究。 2.噬菌体展示肽对胰岛素受体的结合活性通过HepG2细胞系来研究小肽与胰岛素受体的结合活性，培养HepG2细胞至对数生长期，用细胞竞争性ELISA方法来检测。结果显示，小肽ZJ1和ZJ2都能够竞争抑制胰岛素与其受体的结合，并且抑制作用呈剂量依赖性。当小肽剂量到达10-7M时，其能够完全抑制胰岛素与其受体的结合。小肽ZJ1和ZJ2的半数抑制率分别大约是6.5×10-10M和9.7×10-10M。这些都表明我们筛选到了具有胰岛素相似表位的小肽。 3.噬菌体展示肽对正常ICR小鼠血糖的影响对正常ICR小鼠随机分组，分别注射多肽、胰岛素以及生理盐水，用邻甲苯胺法检测并比较注射前和注射45min后的血糖值。结果显示：小肽ZJ1(约以4mg/kg注射)具有明显的降血糖作用，小肽ZJ2(约以4mg/kg注射)则有一定的升血糖效应。 4.噬菌体展示肽对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响用四氧嘧啶制备小鼠糖尿病模型，并按空腹血糖和体重随机分为模型对照组和实验组。禁食12h后，实验组小鼠予以注射1mg/ml的多肽(ZJ1)溶液100μ1(0.9％生理盐水配制)；模型对照组小鼠给予等体积0.9％生理盐水。结果显示，多肽ZJ1能够明显的降低糖尿病小鼠的血糖，降幅为23％，说明该多肽有降血糖的作用，具有类胰岛素的生物学活性；而比较糖尿病对照组注射前后血糖值，显示无显著差异。 综上所述，用噬菌体展示技术，我们筛选到了能够模拟胰岛素的环肽，通过细胞生物学活性检测，小肽CPTSQANSC(ZJ1)能够竞争性的抑制胰岛素与其受体的结合，并对正常小鼠和四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠，都有明显的降血糖作用。这或许对进一步设计类胰岛素小分子药物，治疗胰岛素依赖性糖尿病提供了新线索，为研究胰岛素与其受体的结合提供了新的思路。