【摘 要】
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近年来,鸡星状病毒（Chicken Astrovirus,CAstV）的感染在国内外十分普遍,其引发的雏鸡肠炎、肾炎和发育迟缓等疾病对养禽业造成了一定危害。20世纪90年代,研究人员在鸡的粪便中发现和星状病毒类似的病毒颗粒,随后在南非、美国和尼日利亚等国家,研究人员相继发现CAstV的感染情况。虽然国内已经有了一些关于鸡星状病毒的流行情况的调查,但有关国内CAstV流行株的研究仍然较少。本研究对江
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目号:32072839, 31772734）； NSFC-RCUK-BBSRC （Grant No.31761133002）； 江苏省优势学科建设项目； 江苏高校“青蓝工程”；
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近年来,鸡星状病毒（Chicken Astrovirus,CAstV）的感染在国内外十分普遍,其引发的雏鸡肠炎、肾炎和发育迟缓等疾病对养禽业造成了一定危害。20世纪90年代,研究人员在鸡的粪便中发现和星状病毒类似的病毒颗粒,随后在南非、美国和尼日利亚等国家,研究人员相继发现CAstV的感染情况。虽然国内已经有了一些关于鸡星状病毒的流行情况的调查,但有关国内CAstV流行株的研究仍然较少。本研究对江苏部分地区鸡星状病毒的感染情况进行流行病学调查分析,了解主要国内流行株类型及其分布特征,并使用鸡胚和LMH细胞成功分离了一株鸡星状病毒,命名为CAstV/CZ1801,同时对其进行了全基因序列测定,并分析其遗传进化关系及生物学信息特征。为了了解CAstV分离毒株的致病性,进行了 CAstV的动物攻毒实验;并且通过杆状病毒表达系统表达了鸡星状病毒的衣壳蛋白,以此为免疫原制备了抗鸡星状病毒衣壳蛋白的单克隆抗体,为后续衣壳蛋白生物学特性的研究以及鸡星状病毒检测方法奠定了基础。1.鸡星状病毒的流行病学调查及病毒分离鉴定本研究从江苏部分地区养殖场采集了 98份雏鸡肠道样本,利用分子生物学方法进行了 CAstV感染情况的调查。结果显示总阳性率高达69%,测序结果显示被检样品均为Ⅱ型CAstV。使用鸡胚和LMH细胞成功分离了一株鸡星状病毒,命名为CAstV/CZ1801,同时对其进行了全基因测序测定,并分析了病毒遗传进化关系及生物学信息特征。结果显示此分离株具有典型的星状病毒基因组的结构特征,与本实验室前期分离的CAstV/NJ1701以及其他两株中国星状病毒分离株CAstV/GDYHTJ和CAstV/HBLP具有较高的同源性（97.5%-98.7%）,属同一分支。与GenBank其它已公布的序列比对结果显示,CAstV/CZ1801株的ORF1a和ORF1b氨基酸序列同源性分别为86.4%～87.0%和77.9%～86.9%;ORF2的氨基酸同源性差异明显,在38.8%～95.9%之间,属于Bi族CAstV。2.鸡星状病毒的致病性实验将实验室分离鉴定的两株鸡星状病毒分离株CAstV/CZ1801 和CAstV/NJ1701通过口服和腹腔注射接种1日龄SPF雏鸡。通过观察其生长发育状态,评价其血清抗体水平,检测其排毒情况和病毒在体内不同器官的复制水平,来评价鸡星状病毒的致病性。结果显示,CAstV/NJ1701攻毒组可引起雏鸡明显的生长抑制,而另一组生长状态无异常;在攻毒14天开始产生抗体,21天达到较高水平;在攻毒后首日其排毒量最高,而后排毒量呈波动下降趋势;不同日龄的各器官病毒载量检测结果显示,病毒首先在肠道组织中表现出较高的分布水平,而在攻毒后的3-7天,在肾脏组织中分布水平最高,在攻毒14天以后,病毒主要存在于腺胃组织中,在其他组织中基本检测不到病毒的分布。两组攻毒组雏鸡经解剖,均未见肉眼可见的器官病理变化。3.鸡星状病毒单克隆抗体的制备本研究将鸡星状病毒衣壳蛋白基因克隆到杆状病毒真核表达体质粒中,转座后获得了重组杆状质粒Bacmid-CAstV-Cap,转染至Sf9细胞获得重组杆状病毒rBacmid-CAstV-Cap,成功表达出Ⅱ型CAstV衣壳蛋白,以小鼠多抗血清为一抗,经间接免疫荧光和Western Blot验证,所表达的蛋白具有良好的反应原性。并以此为免疫原免疫小鼠,经细胞融合后筛选出4株能够稳定分泌CAstV衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,均可与天然病毒进行反应,命名为CAstV-Cap-6H3、CAstV-Cap-5A11、CAstV-Cap-3A2、CAstV-Cap-3E12。特异性实验结果显示,四株单抗的杂交瘤上清与实验室常见禽源病毒ALV-J、AIV、IBV、MDV等病毒均无交叉反应。经试剂盒的亚类鉴定,两株单抗为IgG1亚类,一株为IgG2b亚类,还有一株为IgM亚类,轻链均为Kappa链。
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