重组人BMP-4/7复合基因腺病毒转染SD大鼠BMSCs并诱导其向类髓核细胞分化的实验研究

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jianzhang5555
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目的:(1)对SD大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs)进行体外培养及传代,观察BMSCs的生长特点及生物学特点。(2) rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7复合基因腺病毒的扩增及病毒滴度测定。(3)将rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7复合基因以腺病毒为载体转染BMSCs,观察其表达。(4)观察转染对BMSCs增殖、分化及功能的影响。方法:(1)取4周龄SD大鼠(雌雄不分)股骨、胫骨骨髓行密度梯度离心法分离培养BMSCs,取第3代细胞进行转染。(2)利用HEK293T细胞扩增已用GFP标记的rhBMP-4、rhBMP-7、rhBMP-4/7复合基因腺病毒并测定病毒滴度。(3)实验分成4组:A组:转染rhBMP-4基因腺病毒组;B组:转染rhBMP-7基因腺病毒组;C组:转染rhBMP-4/7复合基因腺病毒组;D组:空白对照组。(4)于转染后培养21d行组织学及免疫组化学观察;于转染后培养4d、14d、21d行PCR检测I、II型胶原蛋白、蛋白聚糖基因的表达。结果:(1)液相倒置显微镜下观察,细胞接种之初,培养瓶中细胞较多,随着培养时间延长可见细胞贴壁生长,其中有少量呈成纤维细胞样外形的贴壁细胞,以后这些细胞呈克隆生长。HE染色后光镜下观察,培养的BMSCs呈梭形、多角形,有多个突起,胞浆淡蓝色,含有较大的颗粒,细胞核可见数个深蓝色的核仁,细胞分裂相多见。(2)病毒保存液MOI值为50~100。测得腺病毒滴度为5×106PFU/mL。(3)腺病毒转染BMSCs后24小时即可见绿色荧光蛋白(GFP)表达,而后逐渐增加,约6-7天表达趋于稳定。病毒MOI值为100时感染SD大鼠BMSCs效率较高,且不影响细胞正常增殖,细胞较少出现病理现象,细胞活性无明显降低。(4)转染后培养21d,细胞球直径约为lmm。A、B、C组HE染色示细胞呈软骨细胞样形态,甲苯胺蓝染色呈阳性;D组阴性;转染后培养2ld,A、B、C组II型胶原蛋白表达呈阳性,但C组染色较A、B组深;D组肉眼基本不可见。PCR检测示:I型胶原蛋白表达量随培养时间延长A、B、C组均增加,且各组间无差异性(P>0.05),II型胶原蛋白表达在同一培养时间A组优于B组而次于C,培养14d、21d无差异,蛋白聚糖表达在同一培养时间B组优于A组而次于C,培养14d、21d无差异。结论:rhBMP-4能增加转染后BMSCs II型胶原蛋白的表达,rhBMP-7能增加转染后BMSCs蛋白聚糖的表达;rhBMP-4/7复合基因可能具有协同作用同时增加转染后BMSCs蛋白聚糖和II型胶原蛋白的表达,能促使其分化更接近于髓核细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞。
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