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B细胞连接蛋白(BLNK)是胞内接头蛋白,主要在脊椎动物B淋巴细胞与巨噬细胞中表达。在哺乳动物体内,BLNK是BCR信号通路中的关键分子,通过参与机体的适应性免疫发挥作用,同时BLNK参与调节B淋巴细胞的增殖、分化以及凋亡等过程。目前已经发现的七鳃鳗的化石可以追溯到奥陶纪,是至今为止发现的最古老的无颌类脊椎动物。因为七鳃鳗不仅具有先天性免疫防御,还具有适应性免疫防御,因此科研专家们把七鳃鳗作为适应性免疫起源的模式生物来进行研究。本实验前期已经发现在七鳃鳗体内含有七鳃鳗B细胞连接蛋白(L-BLNK-like),那么L-BLNK-like在七鳃鳗体内具有怎样的功能?七鳃鳗中的VLR介导的适应性免疫又与本文所研究的L-BLNK-like之间有什么联系呢?本篇论文根据前期工作,在已经得到七鳃鳗L-BLNK-like序列全长的基础上,利用分子生物学的手段,选取序列比对一致性85%以上的C端区域,设计引物,以白细胞cDNA为模板,对该片段进行克隆、原核表达以及抗体制备,进而初步探究L-BLNK-like在七鳃鳗体内的免疫学功能,最终为研究七鳃鳗体内VLR介导的免疫反应提供重要的线索。本篇论文在已知七鳃鳗L-BLNK-like的cDNA全长序列的基础上,选取序列比对一致性85%以上的C端区域,设计引物,基因克隆,构建pET-28a-L-BLNK-like重组质粒,IPTG原核诱导表达出重组蛋白,His亲和层析,得到rL-BLNK-like纯品。经质谱鉴定后,确定为正确的L-BLNK-like。将得到的rL-BLNK-like纯品,利用新西兰兔进行免疫,制备兔抗七鳃鳗L-BLNK-like多克隆抗体,经ELISA检测合格后,收集并纯化抗体,并利用Western blot检测抗体与抗原的结合能力。结果显示,利用兔抗七鳃鳗L-BLNK-like多克隆抗体,不仅可以检测到rL-BLNK-like,还可以检测到七鳃鳗体内的天然蛋白L-BLNK-like,为下一步研究L-BLNK-like的相关免疫功能提供了很好的实验基础。利用Western blot检测LPS免疫前后七鳃鳗不同组织中L-BLNK-like的表达水平变化程度,并用流式细胞技术量化检测LPS免疫前后七鳃鳗白细胞中L-BLNK-like的表达量差异情况,以上实验表明L-BLNK-like与七鳃鳗免疫防御有关。由于七鳃鳗体内存在VLR介导的适应性免疫,因此利用Western blot方法检测VLRB在LPS免疫前后各组织的表达情况,得到与L-BLNK-like一致的结果。利用激光扫描共聚焦检测得到VLRB和L-BLNK-like可以共存在同一个细胞。因此,可以表明L-BLNK-like可能参与VLR介导的免疫反应,对日后研究七鳃鳗中VLR介导的免疫防御提供了重要的参考价值。