论文部分内容阅读
草莓(Fragaria ananassa Duch.)属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物。草莓果实鲜美,多汁,营养价值高,含有丰富Vc,草莓果实富含的营养容易被人体消化、吸收,是老少皆宜的健康食品。每年夏季6~7月间是果实成熟采摘季节。但由于其果皮极薄,含水量高,容易受微生物侵染和机械损伤而腐烂变质,不耐贮运,传统的贮藏保鲜技术对草莓果实的保存时间并不长,在运输贮藏过程中造成很大的经济损失。自上世纪八十年代末开始,国外一些试验室开展了利用转基因技术延长果蔬成熟衰老过程的研究,我国在相关方面的研究起步较晚但发展很快,目前已有多种植物利用反义ACS或ACO基因技术来延迟果实的成熟衰老过程。相关研究表明,在草莓果实成熟阶段,乙烯的大量表达可能与受体基因FaErs1有关。深入研究FaErs1基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的关系,从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。因此,本试验以全明星草莓组培叶片为原材料,提取植物DNA基因组,设计特定引物,经PCR扩增得到目的片段。用于构建Ers1目的片段的反义载体和RNAi表达载体。从而达到封闭该基因的效果。主要结果如下:⑴根据草莓乙烯受体FaErs1的基因序列,设计一对特异性引物,通过PCR的方法,从总长为2082bp的全明星草莓乙烯受体基因中克隆到一段长为667bp的乙烯受体FaErs1基因片段。通过测序及使用DNAMAN生物学软件进行同源性等分析,结果表明克隆片段与GenBank中注册的Chandler-Ers1同源性高达99%。可以表明克隆片段即为全明星草莓乙烯受体FaErs1基因片段。⑵设计一对带有SmaⅠ-BamHⅠ酶切位点特异性引物,反向克隆全明星草莓FaErs1基因片段,连接至pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Ers1。酶切下中间表达载体pBI221-anti-Ers1的CaMV 35S启动子和FaErs1的反义序列,定向插入到切除CaMV 35S启动子的pBI121质粒中,构建成反义表达中间载体pBI121-anti- Ers1。⑶设计一对带有XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点特异性引物,正向克隆全明星草莓FaErs1基因片段,连接至pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Ers1。切下中间表达载体pBI221-anti-Ers1上的35S启动子和正义序列,将其插入到切除了35S启动子的pBI121-anti-Ers1质粒中,构建成RNAi植物表达载体pBI121- Ers1-RNAi。⑷利用冻融法将pBI121-anti-Ers1、pBI121-RNAi-Ers1两个表达载体转化到农杆菌LBA4404中,经特异性引物对转化菌液的PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。