目的:肺癌是目前全球和我国发病率及死亡率最高的肿瘤,总生存率仍处于较低水平,主要原因是肺癌早期筛查及早期诊断方面存在明显不足。因此,进一步深入了解肺癌的发病机制,并寻找灵敏度高、特异性强的肺癌早期筛查和诊断标记物具有重要的科学和临床意义。本文首先利用生物信息学及分子生物学实验,在细胞、组织及分子水平分析和探讨分选连接蛋白3(sorting nexin 3,SNX3)在调控非小细胞肺癌发生的作用及其分子机制。为了进一步分析和了解非小细胞肺癌患者驱动基因的基因型并探讨其与SNX3的相关性,本研究收集了2016年1月-2017年6月就诊于青岛大学附属医院胸外科的非小细胞肺癌患者,通过人EGFR基因检测试剂盒等确定患者主要驱动基因的基因型,并进一步分析了非小细胞肺癌患者表型、基因型及其与SNX3的相关性。方法:(1)第一部分:1.利用分子生物学方法,构建SNX3过表达载体和SNX3-RNAi载体,经测序和蛋白印迹实验验证后,大量提取质粒并冻存。经HEK293T细胞成功包装逆转录病毒后,感染H1299细胞,筛选并鉴定出稳定表达或敲减SNX3人肺癌细胞系H1299。2.取2×10~4/ml生长状态良好的稳定表达或敲减SNX3的H1299细胞,培养至24、48、72和96 h时,利用细胞增殖试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)分析细胞的增殖水平。3.取生长状态良好的稳定表达或敲减SNX3的H1299细胞,接种于10 cm细胞培养皿,连续培养至第18天后收样,计算并统计细胞克隆数。4.将200μl的3×10~5/ml细胞接种至经Matrigel胶包被的Tranwell小室,于细胞培养箱中常规培养24 h后,固定和染色后,计数并统计穿透基底膜的细胞数。5.非小细胞肺癌肿瘤组织及癌旁组织提取蛋白后,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,蛋白印迹法检测癌和癌旁组织中SNX3的表达量。6.取2.5×10~6生长状态良好的稳定敲减SNX3的H1299细胞和对照组H1299细胞,注入SPF级BALB/C裸鼠右后肢。每两天测量和记录成瘤后肿瘤的长径和短径,并计算肿瘤的体积。观察至第24天时,处死全部裸鼠,分离皮下瘤体,称重并分析。7.采用RNA干扰和过表达方法,Western blot检测SNX3、WTAP在肺癌中的作用机理,从而明确两者的相互调控关系。(2)第二部分:1.收集2016年1月至2017年6月就诊于青岛大学附属医院胸外科的原发性非小细胞肺癌患者。患者纳入标准为:具有原发性非小细胞肺癌病灶;在知情同意的原则下行外科切除手术并获得足够的样本;在手术前患者未进行过任何药物及其他治疗。术前诊断主要依据影像学检查等,并由病理检查结果确诊。患者年龄、性别和籍贯、居住地等人口学信息;吸烟状况及肿瘤部位、体积、是否侵及胸膜、病理检查结果等临床资料录入患者信息表。肿瘤组织在手术切除后迅速保存至平衡液中,运送至实验室,提取总DNA,经质检后,样本冻存于液氮。2.利用人类EGFR基因突变检测试剂盒、人类KRAS基因突变检测试剂盒、人类ROS1基因突变检测试剂盒、人类BRAF基因突变检测试剂盒、人类PIK3CA基因突变检测试剂盒和人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒分析患者基因型。3.通过筛选肺癌的常见突变基因与SNX3的相关性进行研究,并进行了相关的生物信息学分析。结果:(1)SNX3促进肺癌H1299细胞的增殖:过表达SNX3对H1299细胞的增殖有明显的促进作用,随着时间的延长,其促进效应越明显;而SNX3-RNAi证实了抑制内源性SNX3的表达后,H1299细胞的增殖能力显著减弱。(2)敲低内源性SNX3抑制了H1299细胞的侵袭性:经过24小时的培养,抑制内源性SNX3的H1299细胞,分解细胞外基质并穿通Transwell小孔的数量显著低于对照组。(3)非小细胞肺癌组织中SNX3表达水平明显升高:与癌旁组织相比,蛋白印迹实验证实肺癌组织中SNX3的表达水平明显升高。含有EGFR突变非小细胞肺癌组织中的表达水平较非EGFR突变非小细胞肺癌组织偏高。(4)SNX3对人肺癌H1299细胞的成瘤性的影响:与对照组相比,抑制内源性SNX3的H1299细胞,其肿瘤表现出成瘤晚、瘤体小的特点,证实敲低SNX3的表达抑制了人非小细胞肺癌H1299细胞的成瘤性。(5)通过RNA干扰方法在H1299细胞系中下调SNX3,发现WTAP及PI3K/AKT信号通路均下调,而过表达SNX3,WTAP及PI3K/AKT信号通路均上调。然而下调或者上调WTAP对SNX3及PI3K/AKT信号通路均未有明显影响,该结果进一步证实SNX3经由PI3K/AKT信号通路调控了核内WTAP的表达,进而调控了肺癌的增殖。(6)本研究收集的201例肺癌患者,其中男性患者106例,占52.7%;女性患者95例。虽然患者中仍以中老年人居多,但年轻患者比例在增加,尤其是女性年轻患者。与之前资料比较,患者吸烟率显著降低。病灶以TNM分期I期为主,位置分布无明显差异,瘤体直径大多在30 mm以下。(7)在201例病灶标本中,EGFR、KRAS、ROS1、PIK3CA和BRAF基因突变以及ALK融合突变的检出率分别为49.75%(100例)、4.48%(9例)、0.50%(1例)、0%(0例)、0%(0例)和3.48%(7例)。(8)肺癌患者表型与基因型相关性分析:本研究在确定病灶驱动基因的基因型后,利用统计学方法分析了各类表型患者的基因型,结果显示两者无显著的相关性;采用生物信息学工具分析发现EGFR基因的表达与SNX3的表达呈现存在显著的相关性。结论:(1)通过生物信息学分析,我们筛选出了与非小细胞肺癌发生密切相关的分子SNX3;(2)通过细胞实验检测发现,过表达SNX3促进了H1299细胞的增殖与克隆形成;而敲减SNX3的表达则抑制了H1299细胞的增殖与克隆形成;(3)采用细胞实验发现,过表达SNX3促进了H1299细胞的侵袭;而敲减SNX3的表达则抑制了H1299细胞的侵袭;(4)采用裸鼠体内实验证实:敲减SNX3的表达,抑制了H1299在裸鼠体内的成瘤性;(5)采用Western blot检测对SNX3的机制研究发现:SNX3经由PI3K/AKT信号通路调控了核内WTAP的表达,从而促进了肺癌细胞的增殖和侵袭。(6)将本研究中的肺癌患者进行检测,经统计学分析发现肺癌患者的驱动基因基因型与表型无明显相关;(7)EGFR基因是本研究纳入的非小细胞肺癌患者中的主要驱动基因;(8)通过生物信息学分析发现,EGFR基因与SNX3的表达呈明显的相关性。