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许多天然和半合成甾体化合物在医药领域和食品行业中占有重要地位。作为具有良好活性的药用中间体,羟基化的甾体化合物天然含量稀少,提取繁琐,化学合成困难,阻碍了对它们进一步的开发研究。寻找方法解决这类天然产物来源的问题显得迫在眉睫,我们希望通过生物催化的方法解决上述难题。细胞色素P450氧化酶是甾体羟基化酶的典型代表,尤其是来源于巨大芽孢杆菌的P450BM3。利用合成生物学的手段研究P450,可以以一种经济又环保方式得到羟基化甾体中间体。本论文主要论述了对细胞色素P450 BM3突变体的功能鉴定和酶学性质探究,及对来源于植物虎眼万年青的P450基因的克隆和表达,主要研究结果如下:1.BM3突变体M01A82W、M01A82WS721和M11A82W甾体底物特异性的研究本实验以13种甾体化合物作为探针研究三个具有代表性的BM3突变体M01A82W、M01A82WS721和M11A82W的底物特异性。酶促催化结果显示只有3-keto-A4-steroids结构的睾酮、甲睾酮、黄体酮、17α-OH黄体酮和雄烯二酮可以被羟基化得到不同位点和不同构型的化合物,而其他8种3-hydro-△5-steroids不能被羟基化。结果表明 pET28aM0182、M018272 和 M1 182 酶可能更偏爱 3-keto-△4-steroids底物。2.BM3突变体139-3催化甾体羟基化本研究以BM3 139-3及其突变体为生物催化剂筛选13种甾体底物,并对其进行深入的酶学性质研究,以期扩大其底物谱。酶促催化结果显示,139-3能够在1α位特异性将雄烯二酮羟基化为1α-OH-雄烯二酮。为了能够工业化应用BM3突变体139-3催化C-1α羟化反应,进行催化条件(反应温度,反应时间,pH和底物浓度)的优化。研究结果表明BM3突变体139-3在37 ℃,pH 7.0反应4小时,能获得雄烯二酮37%的最高转化率。此外,为了提高139-3酶活性和扩大底物范围,我们对139-3进行随机突变。测序结果表明139-3共有5个位点发生突变,得到4个突变体,并且所有突变体在379位氨基酸处发生突变,导致R379S,而且失去了对雄烯二酮的羟基化活性。研究表明位于379位的精氨酸残基在139-3的羟基化活性中起关键作用。3.虎眼万年青中P450基因的克隆和表达提取虎眼万年青无菌组织的总RNA,逆转录得到cDNA。依据虎眼万年青转录组序列,设计引物,利用巢式PCR克隆得到3条细胞色素P450氧化酶基因(Os5155、Os813和Os9107)。利用In-Fusion原理设计引物,构建了真核表达载体,继而根据实验需求截短P450基因,构建了原核表达载体。通过与分子伴侣dnaK-dnaJ-grpE的共表达,获得t27pET28a/5155和t29pET28a/9107的可溶性表达,为以后P450基因的功能鉴定打下基础。