背景Peutz-Jeghers综合征(PJS)是一种以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发息肉为特征的常染色体显性遗传病。PJS息肉散布于胃肠道的各个部位,息肉的病理类型主要为错构瘤。以往认为这种错构瘤性息肉各种细胞形态发育正常,分化良好,无核异型性,发生癌变的几率很小,但近来国内外研究认为PJS患者发生消化道肿瘤或伴胃肠道外器官(胰腺、卵巢、睾丸、乳腺、子宫、肺等)肿瘤的风险是普通人群的15.2倍,至65岁其累积危险度高达93%。PJS的主要致病基因是LKB1,研究报道有大约30～67%的PJS存在LKB1基因的胚系突变,小部分存在体细胞突变,且有明确家族史的PJS患者中只有10%-20%可能由于de novo LKB1胚系突变引起。这种遗传异质性意味着仍有相当一部分的PJS无法单独用LKB1突变来解释。Nicholas在迄今最大规模的临床研究中(419位PJS患者)发现,LKB1的突变与PJS癌变发生率并不相关,Hamid对于46个PJS家系的研究也证实了此观点,高度提示还有其它基因或信号通路参与了PJS演变的过程。新的观点认为肿瘤起源于干细胞行为缺陷,此时,正常的不对称分裂模式被破坏,干细胞将会生成两个具有干细胞特点的子细胞并蓄积形成新生物,比如息肉。一些调节干细胞自我更新的通路如Notch、 Hedgehog、Wnt通路都涉及到了致癌作用。众多关于Hedgehog (HH)信号通路在肿瘤中作用的研究显示目前至少25%的肿瘤生成与HH信号通路的异常活化有关。胃肠道的发育始于内胚层,HH通路作为最重要的内胚层分子信号,在越来越多的研究中被证实与消化道肿瘤的发生密切相关。目前,在哺乳动物体内的三种HH同源物质中,以Sonic hedgehog (SHH)关注。研究者们认为由SHH蛋白表达异常或信号通路活性异常所诱发的干／祖细胞增殖失调节这一机制可能参与了所有的胃肠道肿瘤。特别是在一些消化道的癌前病变(如Barrett食管、胃粘膜肠上皮化生、萎缩性胃炎、胰腺上皮内瘤变),以及炎症性肠病(如溃疡性结肠炎、克隆恩病)中也发现了SHH/GLI1信号通路的上调。而且,SHH的活化与结肠肿瘤的pTNM/UICC分期以及肿瘤大小无明显相关,这提示SHH调节异常是漫长结肠癌变过程的早期事件,已经存在于息肉之中。近来研究发现LKB1是可以调节HH信号通路的重要组件,并证实了LKB1通过控制初级纤毛的长度来影响HH信号的反应性,而LKB1减弱将使HH信号受抑。这无疑为进一步探索LKB1的功能以及PJS错构瘤的形成和恶变机制提供了新思路。在PJS错构瘤的发生和进展过程中,LKB1与SHH/GLI1信号通路的相互关系可能发挥了重要作用。研究目的本课题首先研究PJS组织中HH信号通路的重要配体SHH和下游关键因了GLl1的表达,探讨PJS组织中SHH/GLI1信号通路的状态。进而结合LKB1的表达探讨它们之间可能的相互关系,旨在从一个新的方向来研究PJS的发病及恶变机制。另外通过对正常肠粘膜组织、结肠腺瘤及结肠腺癌组织中3种分子的表达分析,探讨它们在不同组织中的表达情况及演变趋势。材料与方法1、LKB1、SHH、GLI1mRNA检测：选取14例PJS错构瘤、14例结直肠腺瘤、14例结直肠腺癌、14例癌旁正常肠粘膜组织,提取新鲜组织总RNA,针对其基因CDS区设计引物,通过逆转录及实时荧光定量PCR方法检测LKB1、SHH、GLI1mRNA表达水平。2、LKB1、SHH、GLI1蛋白检测：选取20例PJS错构瘤、25例结直肠腺瘤、25例结直肠腺癌、20例癌旁正常肠黏膜组织的石蜡标本,通过免疫组织化学法在同一组织来源标本的连续切片中检测LKB1、SHH、GLI1蛋白的表达部位及程度。3、统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。计量资料的多组独立样本比较,采用单向方差分析(One-way ANOVA);如果资料不符合正态分布或是多组等级资料,采用秩和检验方法(Kruskal-Wallis H)。LKB1、SHH、GLl1三者之间表达水平的相关分析采用偏相关分析方法。以双侧α=0.05作为检验水准,检验标准以P≤0.05为有显著性差异或有相关关系。r偏相关系数表示三者中两两之间相关关系的密切程度。结果1、Real-time PCR结果显示在mRNA水平,LKB1在PJS息肉组织的相对表达量为2.65±1.54,与腺瘤组(4.57±3.48)相比,差异无统计学意义；明显低于腺癌组(8.42±3.92),差异有统计学意义。SHH、GLI1在PJS组的相对表达量分别为2.64±1.59、3.27±2.11,明显高于正常组(1.18±0.79、0.98±0.51),低于结肠腺瘤组(4.74±2.32、4.63±3.11)和结肠腺癌组(8.89±4.26、9.06±4.73),与腺瘤组的差异无统计学意义。2、免疫组化结果显示LKB1、SHH、GLI1三种蛋白在四组组织的表达主要局限于上皮细胞层,亚细胞定位主要在细胞膜和胞浆,GLl1蛋白在腺癌组的胞核染色增加。正常组中SHH和GLl1蛋白主要表现为不表达(17／20,18／20)或微弱表达(3／20,2／20),未检出核染色。LKB1蛋白在PJS组的表达有两种不同模式,一种表现为腺体上皮细胞的胞膜胞浆染色,另一种表现为蛋白表达缺失,相应的SHH和GLl1蛋白呈现胞浆微弱表达甚至无表达。腺瘤组和腺癌组的蛋白表达与细胞的异型性有关,细胞形态正常区域LKB1、SHH、GLI1三者的表达相对弱于异型细胞分布区域。3、LKB1蛋白在正常粘膜组的平均秩为18.68,在PJS组的平均秩为22.33,差异无统计学意义(P=0.305)。SHH蛋白在正常粘膜组的平均秩为16.88,在PJS组的平均秩为24.13,PJS组的SHH染色强度明显高于正常粘膜组,差异具有统计学意义(P=0.018)。GLl1蛋白在正常粘膜组的平均秩为17.05,在PJS组的平均秩为23.95,PJS组的GLI1染色强度明显高于正常粘膜组,差异具有统计学意义(P=0.017)。多组间的比较结果显示正常肠粘膜组织、PJS错构瘤息肉、结肠腺瘤及结肠腺癌四组间LKB1、SHH、GLI1蛋白的阳性表达率和表达程度的差异均具有统计学意义(P值均小于0.05)。三者在正常肠黏膜组的阳性表达率和表达强度最低,其后依次是PJS组、结肠腺瘤组、结肠腺癌组。组间两两比较PJS组和腺瘤组之间差异无统计学意义(P值均大于0.05)4、相关性分析结果：在mRNA水平,LKB1、SHH相关系数r=0.457(P<0.01)；SHH、GLI1相关系数r=0.314(P<0.05)；LKB1、GLI1相关系数r=0.225(P>0.05),SHH与LKB1、GLI1的表达量呈正相关。在蛋白水平,LKB1、SHH相关系数r=0.224(P<0.05)：SHH、GLI1相关系数r=0.640(P<0.01)；LKB1、GLI1相关系数r=0.363(P<0.01),三者两两之间呈正相关。结论1、大多数的PJS息肉都存在有LKB1的野生型等位基因。LKB1蛋白在PJS息肉中的染色具有多样性,反映了PJS的遗传异质性。2、PJS错构瘤组织中SHH和GLll的表达较正常肠粘膜组织增加,提示配体依赖性SHH信号通路激活在PJS发生中起重要作用。3、癌旁正常粘膜、PJS息肉、腺瘤及腺癌组织中LKB1、SHH、GLI1的表达强度随着肿瘤恶性程度增加逐渐增强,三者的表达水平两两之间呈正相关关系。提示SHH-GLI1信号通路的异常是结肠上皮恶性转化的重要步骤和早期分子事件,且SHH信号通路可能受到LKB1的调节。