H9N2亚型禽流感病毒在欧亚大陆多个国家的不同类型的陆生禽类群体中呈现地方性流行，与其他病原如大肠杆菌、传染性支气管炎病毒、支原体等混合感染能够提高其致病力，引起蛋鸡的产蛋量大幅下降以及死亡率显著提高，给家禽养殖业带来严重的危害。遗传分析表明H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)可分为欧亚禽和美洲禽两个谱系。我国目前流行的谱系是Y280-1ike。该病毒主要感染家禽，但是在活禽市场的健康的家禽和其他珍禽和野生水鸟体内也会携带病毒，同时还会发生跨种间传播给其他哺乳动物如人、猪等，对公共卫生产生巨大威胁。为适应宿主环境的变化和逃避持续高水平的免疫压力，中国H9N2亚型禽流感病毒分离株发生了抗原漂移，并进化成不同的抗原群。抗原漂移是疫苗免疫失败的主要原因，也解释了即使使用疫苗控制，H9N2禽流感病毒在我国仍然呈地方流行性的状况。目前通过单克隆抗体已经筛选了H9N2流感病毒的多个抗原位点，这些位点主要暴露于HA的头部顶端，在巨大的免疫压力和自然选择压力下，极易导致抗原性发生变化。因此有必要加强H9N2亚型禽流感的流行病学监测，把握其遗传进化的动态规律和情况，对我国H9N2亚型禽流感防控以及公共卫生等方面均有重要意义。　　目前的研究对于当前流行株的抗原性变化的分子机制研究报道相对较少。因此，我们制备了华东地区H9N2亚型禽流感病毒流行代表株WJ57的HA蛋白单克隆抗体，结合不同年份毒株的SPF鸡高免血清对1998-2016年部分毒株进行了抗原性差异的比较，并选取W J57和TM118作为模式病毒探究导致抗原差异的位点。这些研究为H9N2亚型禽流感病毒防控提供了依据。　　1.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备　　用2012年分离株W J57作为免疫原，使用经典的免疫学方法进行单克隆抗体的制备，通过免疫小鼠的脾细胞与SP/20细胞的融合及筛选，共获得四株可以稳定分泌单克隆抗体的细胞株1F7C8F5、3G4D6E4、4B12F8、6D1C4。经亚类鉴定，这四株单克隆抗体亚类均为IgG2a。用WJ57病毒感染MDCK细胞，四株单抗克隆抗体进行间接免疫荧光试验检测，均可以发出特异性荧光。四株单克隆抗体分别与不同时期的H9N2亚型病毒株、不同亚型流感病毒以及NDV进行血凝抑制试验，结果显示四株单克隆抗体均只和H9N2亚型的病毒产生特异性反应，并且具有不同的反应谱，与其余病毒无反应。可能这四株单克隆抗体是特异性针对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的不同位点的。这四株单克隆抗体的制备为H9亚型禽流感病毒的快速检测以及下文的抗原性变异分析提供了依据。　　2.不同年代H9N2亚型禽流感病毒抗原进化分析　　为研究不同年代H9N2亚型禽流感病毒的抗原性进化情况，选取华东地区1998-2016年期间不同年代的29株H9N2亚型禽流感病毒，并选择其中的七株分别是F98(1998年)，SH7(2001年)，HeN86（2008年），WJ57（2012年），TM118（2014年），SDKD1(2015年)和AH320（2016年）制备了SPF鸡高免血清。用制各的高免血清和单克隆抗体对这29株H9N2亚型禽流感病毒进行交叉血凝抑制试验。结果显示华东地区H9N2流感病毒经历了抗原漂移，并且逐年增加。早期的F98-like毒株血清与2010之后的分离株交叉血凝抑制效价相差2-32倍;SH7的抗血清与不同年代的毒株交叉反应性相差较大，与28株不同年代的毒株HI效价相差4-32倍。2007-2009年处于F98-like向Y280-like的过渡阶段，HeN86毒株是较早出现的Y280毒株的代表，与之前出现的F98-likeHI效价相差4-32倍，与2010年后成为优势毒株的Y280-like毒株（2010-2014年）的HI交叉反应性相差1-64倍，与2015和2016年的毒株HI交叉反应性普遍相差8-64倍，此阶段很多毒株短暂存在而未成为优势毒株，因此可能与前后分离的毒株抗原性差异较大。WJ57毒株是Y280-like疫苗株，其抗血清与不同年代的毒株交叉反应性都很好，除了TM118毒株。2015-2016年毒株及其抗血清与2014年之前的毒株和抗血清交叉反应性都比较大（4-64倍）。这些数据说明虽然Y280-like仍然是优势流行毒株，但是不同时期的Y280-like的H9N2病毒HA基因在不断进化，抗原性也在发生变化。　　3.H9N2亚型禽流感病毒抗原性差异的机制探究　　为研究导致H9N2亚型禽流感病毒抗原性差异的分子机制，选取抗原性差异较大的两株H9N2亚型禽流感病毒WJ57和TM118作为模式病毒，利用反向遗传技术构建以PR8为骨架的反向遗传重组病毒WJ57-PR8与TM118-PR8，并制备重组病毒的SPF鸡高免血清。通过序列比对，确定12个潜在导致抗原性差异的位点，并在TM118-PR8上进行分区域突变。结果显示，抗原性差异是由HA基因氨基酸第156、159和160位3个氨基酸突变所引起。进一步在WJ57-PR8和TM118-PR8上对这三个位点进行单突变、双突变或三突变，拯救出14个突变病毒，交叉血凝抑制结果显示，TM118毒株HA蛋白156、159和160位氨基酸单个或双突变不会引起TM118抗原性向WJ57改变，必须是3个位点同时突变，但是对于W J57毒株3个位点无论是单突变或者联合突变，都不会使其抗原性向TM118改变。且发现HA单抗4B12F8是特异性针对WJ57病毒HA基因氨基酸160位的。　　综上所述，H9N2 AIV TM118株抗原性向WJ57毒株改变所需要的最小数目的氨基酸是三位即H9N2病毒HA1上第156、159和160位氨基酸。说明少数关键氨基酸位点的改变就可以使禽流感病毒的抗原性发生重大的改变，因此，我们在H9N2亚型禽流感病毒的监测中需要注意HA上关键氨基酸位点的变化，并及时的对疫苗株进行更新。