褐藻多糖硫酸酯对TGF-β1孵育下人肾小球系膜细胞ECM积聚的影响

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[目的]观察褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan FPS)对TGF-β1刺激下人肾小球系膜细胞(Human Mesangial cell HMC)纤连蛋白(Fibronectin FN)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2)分泌及ERK1/2分子磷酸化的影响,探讨褐藻多糖硫酸酯对人肾小球系膜细胞细胞外基质(Extracelluar matrix,ECM)积聚的抑制作用及作用机制。[方法]用TGF-β1作为刺激因子,孵育体外培养的人肾小球系膜细胞(HMC),并分别用不同浓度的FPS干预,具体分组如下:模型组(TGF-β1浓度:4ng/ml)、FPS高剂量组(TGF-β1浓度:4ng/ml+FPS:100ug/ml)、FPS中剂量组(TGF-β1浓度:4ng/ml+FPS:50ug/ml)、FPS低剂量组(TGF-β1浓度:4ng/ml+FPS:25ug/ml)、FPS对照组(FPS:100ug/ml)、正常对照组。ELISA技术检测各组HMC上清液MMP-2、TIMP-2表达水平,Realtime PCR技术检测各组HMC的FN、MMP-2、TIMP-2mRNA表达水平,Westernblot技术检测各组HMC的FN、P-ERK1/2、ERK蛋白表达水平。[结果](1)所培养细胞经免疫荧光鉴定示肌动蛋白、肌球蛋白、波形蛋白、结蛋白表达阳性,Ⅷ因子及细胞角蛋白表达阴性。(2)与正常对照组相比,模型组细胞FN蛋白及nRNA表达水平上调(P<0.01),加入高、中、低剂量FPS阻断后,细胞FN蛋白及mRNA表达明显减少(P<0.01P<0.05)。FPS对照组与正常对照组相比FN蛋白及mRNA表达差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)与正常对照组相比,模型组的MMP-2蛋白及mRNA表达减少(P<0.01),TIMP-2蛋白及mRNA表达(P<0.01)增加;与模型组相比,FPS高、中、低剂量阻断组细胞的MMP-2蛋白及mRNA表达减少、TIMP-2蛋白及mRNA表达增加(P<0.01,P<0.05);FPS对照组与正常对照相比MMP-2、TIMP-2蛋白及mRNA表达差异不具有统计学意义(P>0.05)。(4)与正常对照组相比,模型组细胞P-ERK1/2蛋白表达水平上调(P<0.01)。加入高、中、低剂量FPS阻断后,P-ERK1/2蛋白表达减少(P<0.01),并呈剂量依赖性。FPS对照组与正常对照组相比P-ERK1/2蛋白表达差异不具有统计学意义(P>0.05)。[结论](1)培养出较纯的HMC,为下一步研究FPS对TGF-β1刺激下HMC细胞因子表达的干预作用奠定了基础。(2)FPS能阻断TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞FN蛋白及mRNA表达增加,减少病理状态下细胞外基质的产生,延缓肾小球硬化进程。(3)FPS能阻断TGF-β1刺激下人肾小球系膜细胞MMP-2、TIMP-2表达的比例失衡,阻断了由MMP-2、TIMP-2比例失衡导致的ECM积聚,从而延缓了慢性肾衰竭的进展。(4)FPS能抑制ERK1/2分子的磷酸化,由此可以推断FPS可能部分通过ERK通路阻断TGF-β1导致的肾小球硬化,从而延缓慢性肾衰竭的进展。
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