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文心兰(Oncidium hybridum)是兰科(Orchidaceae)文心兰属植物,具有发展前景的热带花卉。Fd(ferredoxin)和FNR(ferredoxin-NADP~+oxidoreductase)作为高等植物中广泛存在的电子传递蛋白,广泛参与植物细胞的生理生化过程。植物中存在多种类型的Fd和FNR,不仅提供氧化还原的能量,而且在逆境胁迫下发挥作用。本研究对文心兰中Fd及FNR基因进行克隆及分析,并利用过表达及CRISPR/Cas9技术对FdC2及RFNR基因在文心兰类原球茎(protocorm-like body,PLB)的发育进行研究。主要结果如下:1.文心兰Fd基因的克隆及表达分析以文心兰类原球茎及试管苗的混合样品为材料,根据文心兰转录组数据筛选获得7条Fd基因的序列,克隆获得文心兰中Fd基因家族的成员,它们编码的氨基酸数目均少于200个。基本生物信息学分析表明:文心兰Fd基因家族包括1个线粒体型的MFDX和6个叶绿体型的Fd,它们与蝴蝶兰中的Fd亲缘关系较近;文心兰Fd基因家族在进化过程中,受突变压力、自然选择及其它因素的影响形成了使用A/T(U)结尾的密码子偏好性。文心兰Fd基因家族基因表达分析结果表明:文心兰Fd具有组织表达特异性,在文心兰生长发育过程中发挥重要作用,对软腐病胁迫以及高温胁迫均有明显的响应。2.文心兰FNR基因的克隆及表达分析以文心兰类原球茎及试管苗的混合样品为材料,克隆了文心兰RFNR基因序列,该基因编码379个氨基酸。由NCBI数据库下载获得文心兰LFNR基因序列,生物信息学分析表明,RFNR与LFNR都隶属于FNR-like超家族,都具有黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)结合域,两结合域在进化过程中比较保守;两种类型的FNR在氨基酸组成、蛋白结构和构型方面存在明显差异,RFNR比LFNR有更强的保守性。对兰科植物FNR基因的密码子偏好性进行分析表明,其基因密码子的末位在A和T(U)之间存在显著的T(U)偏好性,在C和G之间存在显著的C偏好性;NADP结合域比非结合域有较小的密码子偏好性;自然选择是兰科植物FNR基因形成密码子使用偏好性的主要成因。利用qPCR对文心兰FNR基因进行表达分析,结果表明LFNR和RFNR的表达具有器官分布特异性:LFNR更多地在叶中表达,RFNR多在根中表达;两种类型的FNR基因参与文心兰的生长发育过程,在高温胁迫及软腐病胁迫响应过程中RFNR响应较快并强度更大。3.文心兰FdC2和RFNR的亚细胞定位及在类原球茎中的过表达研究通过构建GFP融合蛋白表达载体在烟草及文心兰叶片中对FdC2和RFNR蛋白亚细胞定位进行分析,结果表明:文心兰FdC2及RFNR均定位于叶绿体。将文心兰类原球茎中FdC2及RFNR进行过表达,结果表明:FdC2过表达的文心兰类原球茎生长过程中形成较长的胚轴,而RFNR过表达的类原球茎较早形成叶片,推测文心兰中FdC2和RFNR参与类原球茎的形态建成。4.CRISPR/Cas9介导的文心兰FdC2和RFNR的基因编辑及基因功能研究本研究对文心兰FdC2和RFNR基因的gDNA序列进行克隆,结果表明:文心兰FdC2基因没有内含子,而RFNR基因由5个内含子和6个外显子组成。利用CRISPR/Cas9技术对文心兰中FdC2和RFNR进行基因编辑,以HRM技术对编辑后的基因进行检测,结果表明:本试验所用CRISPR/Cas9技术在文心兰原生质体及类原球茎中均有编辑效果,其中原生质体编辑后的FdC2编码区第296个碱基的突变使得此位置编码的精氨酸变为赖氨酸,导致该基因编码蛋白质活性中心被影响,蛋白质三级结构发生变化;而编辑后的RFNR基因的5’UTR发生了碱基突变。对基因编辑后文心兰类原球茎进行形态观察,结果表明:FdC2基因被编辑的类原球茎分化减弱,而RFNR基因被编辑后类原球茎基本不分化且部分出现黄化,推测文心兰FdC2及RFNR基因在类原球茎的形态建成中发挥重要的作用。5.Fd3和LFNR转基因文心兰类原球茎的形态建成观察为研究Fd和FNR基因对文心兰类原球茎离体形态建成的影响,以本实验室Fd3和LFNR转基因的文心兰类原球茎进行形态观察,结果表明:Fd3和LFNR偏离正常表达时都影响类原球茎的发育和组织的分化,其中二者的高表达导致脱分化从而抑制类原球茎的正常分化和发育,二者的低表达导致类原球茎形态建成的停滞。综上所述,本研究通过生物信息学、基因克隆、基因表达、遗传转化以及CRISPR/Cas9基因编辑的研究,证明Fd和FNR不仅响应文心兰软腐病及高温胁迫,而且参与并很大程度地影响文心兰类原球茎的形态建成和生长发育。