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糖类物质作为核酸和蛋白质之外的第三类生物大分子,在信号转导、分子识别及免疫应答等生命过程中发挥着重要功能。糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰方式之一,对蛋白质的结构和功能有重要调节作用,而且糖蛋白糖链的异常改变与许多疾病的发生发展有关,因此以糖链结构和功能研究为主要内容的糖组学已成为生命科学的重要领域之一。糖链本身不带发色基团,在分析过程中一般需要进行衍生化,不仅可以使糖链带上紫外或荧光基团,提高检测灵敏度,又可以降低糖链极性,便于色谱分离。但是,现有的糖链衍生化试剂一般仅带一个活性官能团,相应的糖链衍生物缺乏游离活性基团用于进一步的糖芯片制备和功能分析研究,而已报道的少数双官能团试剂仅适用于可获取的还原性N-糖链的分析,对于难以获取还原性形式的糖蛋白O-糖链不适用,通用性不强,难以广泛应用。因此,发展对糖蛋白N-糖链和O-糖链均适用的双官能团发色试剂衍生化方法,对于糖链的结构功能关系研究有重要意义。本研究采用氨基吡唑啉酮异二官能团试剂——3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PAP)作为糖蛋白N-糖链和O-糖链通用的衍生化试剂,不但在酸性条件下可与还原性糖链发生还原胺化反应,生成带有活性亚甲基的糖链单PAP衍生物,而且在碱性条件下可与还原性糖链发生迈克尔加成反应,生成带有活性伯氨基的糖链双PAP衍生物,还可以在碱性条件下实现糖蛋白O-糖链的释放及同时标记PAP,所得糖链样品经石墨碳或C18固相萃取小柱纯化,可直接以高效液相色谱(HPLC)、电喷雾质谱(ESI-MS)及亲水液相色谱-质谱在线联用(HILIC-MS)进行分离检测和定性定量分析,为糖蛋白糖链的进一步固定化分析及功能研究奠定了基础。主要研究结果如下:1、提出并建立了以还原胺化和迈克尔加成这两种不同反应模式对还原性N-糖链标记PAP的新方法。经逐步优化,得到还原胺化反应的最佳条件为:糖链在含有15%冰乙酸的0.625 M PAP/DMF溶液中,于70℃反应2h后,加入0.75 MNaBH3CN水溶液,再于70℃反应1 h。迈克尔加成反应的最佳条件为:糖链在0.75 M PAP/DMF溶液0.3 M NaOH水溶液的等体积混合溶液中,50℃条件下反应1.5 h。这两种衍生化方法对糖链衍生完全,反应特异性高,还原胺化反应所得产物均为带活性亚甲基的糖链PAP衍生物,迈克尔加成反应所得产物均为带活性氨基的糖链PAP衍生物。2、建立了两种不同反应模式下所得糖链PAP衍生物的HPLC分离分析新方法。以麦芽糊精寡糖混合物为糖链标准品,对糖链PAP衍生物的HPLC分离条件进行了系统优化,所得最佳分离条件如下:色谱柱为TSK-GEL Amide-80(250 mm × 4.6 mm,5 μm)分析柱;柱温为20℃;检测波长为254nm;流速为1.0 mL/min;流动相A为乙腈,B为 100 mM 的乙酸铵水溶液(pH=6),梯度:t=0 min,75%A,25%B;t=120 min,55%A,45%B。该分离条件对糖链的两类PAP衍生物具有良好的通用性,糖链分离度均较高。3、应用所建立的PAP衍生化方法对鸡蛋白蛋白和人乳中的N-糖链进行了 ESI-MS和HILIC-MS分析。结果如下:鸡蛋白蛋白N-糖链经PAP还原胺化衍生化共检测到18条糖链,有2条存在同分异构体,分别为H5N6和H6N6;经PAP迈克尔加成衍生化后共检测到22条糖链,有3条存在同分异构体,分别为H3N4F1、H3N5F1和H4N5F1。人乳N-糖链经PAP还原胺化衍生化后共检测到13条糖链,有3条存在同分异构体,分别为H3N6、H4N6和H6N6;经PAP迈克尔加成衍生化后共检测到20条糖链,有2条存在同分异构体,分别为H4N5F1和H4N5SA2。这些结果表明,该方法对不同糖蛋白和复杂生物样品具有良好的应用性,而且糖链的PAP迈克尔加成衍生化产物比还原胺化产物具有更高的质谱检测灵敏度。4、提出并建立了糖蛋白O-糖链释放与同时PAP标记的新方法。以脱唾液酸化牛胎球蛋白为标准糖蛋白,经过系统优化,得到最佳反应条件为:将糖蛋白溶于1.2 M PAP/DMF溶液,并加入等体积1.0 M NaOH水溶液于65℃反应16 h。在此基础上,以所建立的方法成功对猪胃黏蛋白和胎牛血清中的O-糖链进行了释放及HILIC-MS分析,共检测到30条猪胃黏蛋白O-糖链和4条胎牛血清O-糖链,其中包括2条唾液酸化O-糖链,表明该方法对糖蛋白和复杂生物样品中的各种中性及酸性O-糖链均具有良好的适用性。