背景冠心病(Coronary heart disease, CHD)是危害人类健康的心血管疾病之一,其发病机制尚不完全清楚。目前已经明确高血压、高胆固醇血症、肥胖、吸烟、糖尿病是冠心病的危险因素。冠心病是一类受环境影响较大的多基因遗传病,具有遗传倾向性。但其遗传相关病因一直末能完全揭示。因此寻找冠心病和动脉粥样硬化易感基因一直是心血管病研究的重点。随着分子遗传学的发展,基因突变及基因多态性与早发冠心病的关系近年来倍受关注。肌细胞增强因子-2(Myocyte enhancer factor-2, MEF2)属于转录调节因子MADS-box家族,在脊柱动物中家族成员包括四种转录因子MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D,最初被称为肌细胞特异性DNA结合蛋白,突出的功能是控制肌细胞分化过程中的基因转录。然而,最近的一些研究报告表明,MEF2蛋白还在多种细胞的信号传导,激活遗传程序、控制细胞分化、增殖、细胞形态学、生存和凋亡等方面发挥着重要的作用。MEF2转录因子以同源或异源二聚体形式发挥作用,其蛋白多结合在许多肌特异性基因的调控区域控制转录过程。2003年Wang等人首次报道转录因子MEF2A的突变基因作为家族性CHD致病基因,从基因水平探讨了CHD的发病机制,提出了CHD发病机制中的一个新的信号通路。MEF2A基因位于染色体15q26.3,在冠状动脉内皮细胞中高度表达。Wang等人的研究显示,MEF2A影响CHD发病的机理可能是基因突变使基因表达的转录过程发生改变,从而使血管内皮发育异常,形成不正常或功能缺损的血管内皮,继而促进单核细胞的侵入和内皮下基质的暴露造成动脉粥样硬化斑块和血栓的形成,导致冠状动脉粥样硬化的发生。该研究成果被美国心脏病协会评为2004年的十大进展之一。然而,也有多个研究小组发现在众多散发与家族性CHD患者中未发现MEF2A基因突变与CHD的关系,因而对MEF2A突变的致病性存在争议。内皮细胞位于血管腔表面,是一个巨大的屏障体系,可分泌一系列血管活性物质和细胞因子作用于血管壁和管腔维持正常血管紧张度、防止血小板黏附和血栓形成、维持血液流动性、抑制血管炎症和平滑肌细胞增殖、防止炎症细胞的浸润和有害物质的透入等维持血管内平衡。一氧化氮(NO)又称内皮舒张因子(EDRF)是维持这些功能的重要细胞因子。血脂异常(如氧化修饰LDL升高)、吸烟、高血压、肥胖、糖尿病等诸多因素均可刺激血管内皮分泌大量的细胞因子和炎性介质,引发炎症反应,促进炎性细胞与内皮细胞的粘附和血栓形成,从而诱导动脉粥样硬化(AS)的发生。NF-κB参与许多基因,特别是与机体防御反应有关的早期应答基因的表达调控。在机体多种生物学活性物质合成的转录调控中发挥重要作用,并参与了动脉粥样硬化发生发展的多个环节。哺乳类动物核因子κB (NF-κB)转录因子家族(又称Rel家族)包括五个成员：Rel(c-REL)、RelA(即p65)、RelB、NF-κB1(即p50)、NF-κB2(即p52)。常见的激活形式是由多肽链p65和p50蛋白亚基构成的异源二聚体,其激活形式包括p50同源二聚体,p65同源二聚体和p50-p65异源二聚体。激活NF-κB引起白细胞黏附分子如VCAM-1等的表达增加。VCAM-1与受体α4β1整合素结合可诱导内皮细胞内信号改变使内皮细胞变形,介导单核细胞、淋巴细胞与内皮细胞或血管平滑肌细胞的黏附。目前的研究也显示,氧化修饰型LDL(ox-LDL)可以不同程度的激活NF-κB,激活的NF-κB参与了粘附分子如血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)的调节以及某些细胞因子的转录调控。而突变的MEF2A具体影响内皮细胞哪些功能以及其具体作用机制尚不为人知。我们的研究显示MEF2A基因有可能通过影响血管内皮细胞NF-κB参与内皮功能的调节,但具体的作用以及信号通路仍需进一步的研究。目的本研究利用冠心病相关基因MEF2A野生型及其21个碱基突变型质粒转染人脐静脉内皮细胞株,通过检测内皮细胞的增殖、一氧化氮、粘附功能、核内NF-κBp65的水平等方面,探讨MEF2A影响内皮细胞功能改变的可能机制；并加以ox-LDL不同时间刺激正常血管内皮细胞后,观察内皮MEF2A蛋白的表达情况以及内皮粘附功能的改变,从而阐明基因与环境因素共同作用对疾病的影响。本实验旨在通过MEF2A对内皮功能的影响以及机制的研究,探讨MEF2A基因与动脉粥样硬化的关系。方法1.实验质粒由美国Dr.Wang(Clevaland clinic)馈赠,经测序证实。将质粒转化入大肠杆菌DH5。进行体外质粒扩增。HUVEC分为对照组(pc-DNA3-GFP质粒,control组)、野生型组(pc-DNA3-MEF2A质粒,WT组)与突变组(pc-DNA3-21碱基缺失型质粒,△21组),使用脂质体Lipofectime2000转染人脐静脉内皮细胞与Hela细胞,MEF2A质粒均带有Flag标签,Flag蛋白检测确定转染是否成功。2.通过流式细胞仪检测GFP蛋白的表达,选择最佳的稳定转染方法。Western-blot检测MEF2A蛋白的表达水平。3.荧光素酶检测系统检测质粒的转录活性。4.细胞免疫荧光检测各组MEF2A蛋白细胞内定位。5. HUVEC分为对照组、WT组、△21组和siRNA组四组,转染后检测各组内皮细胞的增殖、NO水平。6.收集上述细胞,提取总蛋白与核蛋白,检测各组的粘附功能、核内NF-κB的水平。7.荧光染料BCECF-AM处理的Thp-1细胞与内皮细胞共孵育,进行单核细胞-内皮细胞粘附试验。8.不同时间点,ox-LDL(50μg/ml)刺激正常内皮细胞：ox-LDL刺激内皮细胞O、6、12、24、36小时,收集细胞提取总蛋白与核蛋白检测MEF2A蛋白、粘附因子VCAM-1、以及核内NF-κBp65的水平。结果1.脂质体Lipofectime2000将目的基因转染入人脐静脉内皮细胞,转染后检测到Flag蛋白表达,说明转染成功,且使用流式细胞仪测定转染效率为70%。2. MEF2A野生型和突变型质粒转染的内皮细胞以及对照组内皮细胞均可检测到MEF2A蛋白的表达；与对照组相比较,WT组与突变组MEF2A蛋白均过表达,而后两组之间比较没有明显差别。3.荧光素酶检测显示,突变组质粒转录活性低于野生组。4。细胞免疫荧光结果显示,转染野生型质粒的内皮细胞MEF2A蛋白主要定位于细胞核,而△21组内皮细胞MEF2A蛋白部分滞留在胞浆。5.蛋白印迹法显示,siRNA组MEF2A蛋白表达较WT组减少了80%；与对照组相比,野生型组和△21突变组MEF2A蛋白表达均显著增加,后两者之间比较则无明显差异。6.MEF2A对增殖的影响：转染48小时,野生型组增殖率(0.648±0.053)明显高于对照组(0.344±0.022,p<0.01)；与野生型比较,突变组和siRNA组内皮细胞增殖率下降36.2%(p<0.01)和63.6%(p＜0.011。7.NO表达的结果：转染后24、36、48小时,WT组与对照相比较,内皮细胞一氧化氮水平表达增加,差异有显著性(p<0.01)；转染36小时与48小时,siRNA组和△21组NO表达下降,与野生型组相比差异均有显著性(p<0.01),其中siRNA组下降更为明显。8.VCAM-1的表达情况：WT组(0.076±0.011)与对照组(0.192±0.023)比较,VCAM-1的表达明显下降(p<0.01)。siRNA组(0.435±0.037)和△21组(0.207±0.018)的VCAM-1的表达水平均明显升高,与野生型组(0.07±0.011)相比较有显著差异,其中siRNA组差异更为显著(p<0.01)。9.单核内皮粘附的结果：WT组与对照相比较,粘附于内皮细胞的Thp-1细胞数目减少(p<0.05), siRNA组粘附于内皮细胞的Thp-1细胞数目较野生型组明显增加,差异有显著性(p<0.01)；△21组与野生型组相比,粘附的Thp-1细胞增加,差异有显著性(p<0.05)。10.NF-KBp65的表达情况：蛋白印迹法显示,WT组NF-κB p65表达量较对照组明显减少(p<0.05), siRNA组和△21突变组NF-κB p65蛋白表达均较WT组显著增加,其中siRNA组增加更为明显(p＜0.01)。11.随着50μg/ml ox-LDL作用HUVEC时间的延长,人静脉内皮细胞MEF2A的表达逐渐减少,呈时间依赖性。NF-κB p65以及VCAM-1蛋白的表达逐渐增加,在24小时时蛋白水平达最大值。结论1.成功的使用脂质体进行MEF2A基因的转染,内皮细胞转染效率较好。2.此基因的21个碱基缺失型突变没有改变细胞MEF2A蛋白的表达,但是该质粒转录活性较野生型明显下降；野生型基因转染后的细胞表达的MEF2A蛋白定位于胞核,突变后表达的蛋白则滞留在胞浆。虽然该突变位点没有位于核定位信号区(nuclear localization signal,NLS),但是同样引起蛋白的定位发生了变化。3. MEF2A基因参与了血管内皮细胞增殖的调节。4. MEF2A基因影响内皮细胞NO分子的表达。5. MEF2A基因调节粘附分子VCAM-1和NF-κB的表达。6. ox-LDL成时间依赖性的刺激内皮细胞MEF2A蛋白减少,同时增加了NF-κB与粘附分子VCAM-1的表达。