研究背景:心脏、大脑、肾脏、视网膜等微血管并发症随着2型糖尿病患者病程而增加^[1-2],是引起患者死亡和器官功能衰竭的主要原因^[3-4]。糖尿病血管并发症的发生发展也有一定的规律和过程,其都是从内皮开始^[5-6],逐渐扩散到整体血管^[7-10]。血管内皮损伤是整体血管损伤的源头,而内皮损伤的可能机制已有大量研究报道。其中慢性炎症反应也是内皮损伤的重要原因之一^[11-13]。NLRP3炎症小体可以被钾离子通道开放、尿酸、活性氧族等激活^[14-16],调节半胱天冬酶-1（Caspase-1）的活化进而促进细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟^[17-18],在胰岛素抵抗和糖尿病发生发展中发挥重要作用。我们实验室的前期研究发现,心肌微血管内皮细胞NLRP3炎症小体的激活参与了心肌缺血再灌注损伤^[19],那么NLRP3炎症小体是否在糖尿病血管损伤中发挥了作用仍未可知。脂联素是脂肪细胞分泌的血浆蛋白^[20-22],具有减轻心肌缺血再灌注损伤^[23-24]和改善糖尿病胰岛素抵抗^[25-26]的作用。大量流行病学研究表明,肥胖和糖尿病状态下,机体脂联素水平降低与心血管疾病风险增高密切相关^[27-29]。此外,很多临床和基础研究证明:低脂联素血症与内皮依赖的血管舒张功能降低紧密相关^[30-32]。脂联素具有抗炎^[33]和血管保护^[34]作用,但其具体的分子机制还有待进一步研究。本研究拟通过在体及离体实验探讨NLRP3炎症小体是否参与了糖尿病血管损伤;血浆脂联素水平减低是否介导了NLRP3炎症小体激活;脂联素是否通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻糖尿病血管损伤及具体机制的研究。研究目的:1.阐明NLRP3炎症小体在糖尿病血管内皮损伤中的作用;2.阐明脂联素通过抑制NLRP3炎症小体激活发挥血管内皮保护作用;3.阐明脂联素抑制NLRP3炎症小体激活的具体机制。研究方法:第一部分:NLRP3炎症小体激活引起糖尿病血管内皮功能障碍1.采用高脂饲料喂养8周的方法构建2型糖尿病小鼠模型,采用NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950（1μg/mL）分别孵育普通小鼠和糖尿病小鼠主动脉段。体外HG/HF处理内皮细胞,模拟体内糖尿病的高糖高脂状态;2.Western blot NLRP3炎症小体表达及其下游分子Caspase-1的激活水平,Elisa法检测Caspase-1切割成熟的IL-1β和IL-18水平;3.高糖高脂孵育内皮细胞,Western blot和Elisa法检测NLRP3炎症小体激活水平;4.采用NLRP3炎症小体特异性siRNA处理细胞,检测内皮细胞凋亡和内皮细胞炎症反应,内皮细胞舒张功能;第二部分:脂联素通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻糖尿病血管内皮损伤及其机制研究高脂饲料喂养建立2型糖尿病模型,1400W（2mg/kg,选择性iNOS抑制剂）或EUK134（5 mg/kg,硝基酪氨酸清除剂）腹腔注射4周。1.Western blot和Elisa法检测NLRP3炎症小体激活水平,检测NLRP3和Caspase-1的蛋白表达,用Elisa检测细胞间粘附因子1和细胞血管粘附因子1的含量。2.高糖高脂孵育内皮细胞,Western blot和Elisa法检测NLRP3炎症小体激活水平。3.采用脂联素和NLRP3炎症小体特异性基因过表达质粒转染细胞,检测内皮细胞舒张功能,内皮细胞凋亡和内皮细胞炎症反应;4.采用DHE染得检测各处理组内皮细胞中活性氧的含量;采用免疫荧光染色检测各处理组血管内及培养细胞中硝基酪氨酸的含量。研究结果:1.高脂饲料喂养8周后,小鼠体重显著增加,葡萄糖耐量变差,脂联素敲除鼠与野生小鼠相比,葡萄糖耐量更差。2.和正常对照小鼠相比,T2DM小鼠血管NLRP3炎症小体表达明显增加,其下游Caspase-1激活明显增加,炎症因子IL-1β和IL-18含量明显增加,内皮依赖的血管舒张功能障碍。采用NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950分别孵育正常小鼠和T2DM小鼠主动脉段,发现其能明显改善T2DM小鼠内皮依赖的血管舒张功能。4.高糖/高脂培养基导致HUVECs NLRP3炎症小体激活明显增加,NLRP3炎症小体特异性siRNA能够减轻高糖高脂引起的内皮细胞损伤,具体表现为凋亡减少,内皮功能改善,炎症反应降低。5.脂联素敲除鼠诱导成2型糖尿病模型后,与野生小鼠造成的2型糖尿病相比,血管炎症小体明显增加,血管损伤加重,具体表现在内皮依赖的血管舒张功能下降,血管炎症反应增加。给予NLRP3特异性抑制剂MCC950孵育离体血管,发现两者内皮依赖的血管舒张功能都恢复到基本相同的水平。5.高糖高脂孵育导致HUVECs NLRP3炎症小体激活明显增加,给予脂联素治疗能降低NLRP3炎症小体激活的水平,并且能减轻内皮细胞损伤,具体表现在凋亡减少,内皮功能改善,炎症反应减少。6.NLRP3炎症小体基因过表达质粒转染HUVECs导致炎症小体激活明显增加,给予脂联素治疗能抑制NLRP3炎症小体激活,改善HUVECs功能,但过表达质粒合并脂联素处理细胞,发现脂联素抑制NLRP3炎症小体激活的作用消失了,脂联素对内皮细胞的保护作用也消失了。7.脂联素有抑制氧化硝化应激的作用。脂联素敲除鼠诱导成2型糖尿病模型后,血管硝基酪氨酸水平明显高于糖尿病小鼠,并且其NLRP3炎症小体的激活水平也明显高于糖尿病小鼠。给予1400W（选择性iNOS抑制剂）或EUK134（硝基酪氨酸清除剂）治疗后,发现硝基酪氨酸水平和NLRP3炎症小体激活水平减低到与糖尿病小鼠基本相同的水平。结论:1.NLRP3炎症小体激活是引起糖尿病小鼠血管损伤的重要原因。2.脂联素通过抑制炎症小体激活NLRP3激活发挥血管保护作用。3.脂联素抑制炎症小体激活的具体机制是通过其抗氧化硝化应激的作用。