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双歧杆菌是定植于人体及动物肠道的重要菌群。作为重要的益生菌,对人体具有多种潜在的益生功能,因而广泛应用于乳制品等益生产品中。通常情况下,当人体摄入双歧杆菌后,人体肠道中的双歧杆菌必须达到足够的活菌数目才能有效地发挥其益生功能。然而,酸性条件(如双歧杆菌应用于发酵乳制品中的低pH值、自身发酵过程中所产生的酸性物质乳酸和乙酸等造成的低pH发酵液、人体胃液中的低pH值等)常常导致双歧杆菌的活菌数目大大降低,从而很难到达人体肠道发挥作用时所要求的活菌数目。因而,强的耐酸性被认为是双歧杆菌作为潜在可应用益生菌的重要优良性状之一。但是,大多数的双歧杆菌的耐酸性极差,从而极大地限制了其在益生产品中的应用。因此,提高双歧杆菌的耐酸性则显得非常重要,这将有助于双歧杆菌有效地发挥其益生功能进而广泛地应用于益生产品中。为了提高双歧杆菌的酸耐受性,非常有必要对双歧杆菌的耐酸机制进行全面深入的了解。然而,到目前为止,关于双歧杆菌耐酸机制研究还只是处于起步阶段,其耐酸性机理仍不清楚。本课题从一株长双歧杆菌原始菌株(Bifidobacterium longum JDY1017)和一株短双歧杆菌(Bifidobacterium breve BB8)原始菌株出发,筛选原始菌株的耐酸菌株;在细胞膜水平上对两株耐酸菌株和其相应的原始菌株进行了比较研究,探索细胞膜在双歧杆菌耐酸性中具有的重要作用;同时结合RNA-seq测序技术、实时荧光定量PCR和生理学分析等方法,对短双歧杆菌耐酸菌株(B.breve BB8dpH)和其原始菌株作了比较研究,旨在从转录组水平和生理特性方面解析短双歧杆菌的耐酸机理;此外,结合SDS-PAGE和LC-MS/MS技术等,对两株双歧杆菌(长双歧杆菌B.longum JDY1017和短双歧杆菌B.breve BB8)原始菌株和其相应的耐酸菌株膜相关蛋白作了比较研究,探讨了膜相关蛋白在双歧杆菌耐酸性中的作用,从而对双歧杆菌耐酸机理提供更全面深入的理解,为提高双歧杆菌耐酸性及增强其在益生产品中应用稳定性提供新的策略和理论依据。本研究中,将一株长双歧杆菌(b.longumjdy1017)和一株短双歧杆菌(b.brevebb8)原始菌株长时间暴露于酸性条件,反复筛选原始菌株相应的耐酸菌株,最终筛选获得了一株长双歧杆菌耐酸菌株和一株短双歧杆菌耐酸菌株,其分别命名为bifidobacteriumlongumjdy1017dph和bifidobacteriumbrevebb8dph。通过对耐酸菌株连续传代培养20天,于每天培养后对两株耐酸菌株和其原始菌株进行耐酸性分析,结果表明每天培养后两株耐酸菌株在酸性环境下的存活率明显高于其相应的原始菌株,表明两株耐酸菌株的耐酸表型具有遗传稳定性。本研究中,在以有无吐温-80的mrsc液体培养基培养时,比较分析两株耐酸菌株和其相应原始菌株耐酸性、细胞膜脂肪酸组成、细胞膜流动性以及编码环丙烷脂肪合成酶cfa基因表达。结果显示:在以含吐温-80的mrsc液体培养基培养时,两株双歧杆菌耐酸菌株相对其原始菌株的耐酸性增加倍数(约为104-105倍)显著高于在不含吐温-80的mrsc液体培养基中培养时的耐酸性增加倍数(181和245倍);在以含吐温-80的mrsc液体培养基培养时,相对原始菌株,两株耐酸菌株具有更长的脂肪酸平均碳链长度、更高的c18:1脂肪酸和环丙烷脂肪酸cycc19:0含量、更高的cfa基因表达水平以及更低的细胞膜流动性;在以不含吐温-80的mrsc液体培养基培养时,两株耐酸菌株和其相应原始菌株在脂肪酸组成、cfa基因表达、细胞膜流动性上无显著差异。这些结果暗示,在以含吐温-80的mrsc液体培养基培养时,两株耐酸菌株相对其原始菌株耐酸性显著的增强可能主要归因于其细胞膜的显著变化。综合运用rna-seq测序、实时荧光定量pcr和生理学分析等手段,在以标准mrsc液体培养基(含吐温-80)培养时,对短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)相对于其原始菌株具有更强耐酸性的相关机理作了系统的研究。rna-seq测序结果显示,相对原始菌株(b.brevebb8),短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)中121个基因表达上调了2倍以上,146个基因表达下调了2倍以上;为了验证rna-seq测序结果的准确性,选取了rna-seq得到的27个差异表达基因进行实时荧光定量pcr分析。结果表明:实时荧光定量pcr和rna-seq结果之间存在显著的正相关性(r2=0.91),证明rna-seq结果具有可靠的准确性。耐酸菌株和原始菌株之间差异表达基因结果表明,短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)低表达支链脂肪酸合成前体物质支链氨基酸的合成和转运相关基因,暗示了短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)可能通过降低细胞膜支链脂肪酸的合成,从而导致其具有更低的细胞膜流动性以应对不利酸性环境。此结果从基因表达角度支持了在含吐温-80的mrsc液体培养基培养时,短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)具有比其原始菌株(b.brevebb8)更低的细胞膜流动性;此外,短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)高表达细胞外被组分(细胞壁肽聚糖、胞外多糖)合成相关基因,暗示了短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)可能增强细胞外被(肽聚糖、胞外多糖)阻止氢离子进入细胞的能力;短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)高表达碳水化合物转运及代谢、谷氨酸和谷氨酰胺合成及转运、组氨酸合成相关基因,暗示了短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)可能增强各种碳水化合物的吸收能力、增加细胞内谷氨酸、谷氨酰胺以及组氨酸的含量以应对不利酸性环境。短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)和原始菌株(b.brevebb8)生理学比较研究结果显示:耐酸菌株胞外多糖含量显著高于其原始菌株,h+-atp酶活性显著低于其原始菌株。基于这些结果,我们提出了短双歧杆菌耐酸菌株相对其原始菌株具有更强耐酸性的耐酸模型。在以标准mrsc液体培养基(含吐温-80)培养时,基于两株耐酸菌株和其相应的原始菌株细胞膜相关蛋白比较研究探讨了膜相关蛋白在双歧杆菌耐酸性中的作用。结果显示:长双歧杆菌耐酸菌株(b.longumjdy1017dph)和其原始菌株(b.longumjdy1017)差异膜相关蛋白为与谷胱甘肽代谢相关的氨肽酶n;短双歧杆菌耐酸菌株(b.brevebb8dph)和其原始菌株(b.brevebb8)差异膜相关蛋白分别与胞外多糖合成、寡肽转运、谷氨酰胺转运、蛋白质合成、糖原代谢相关。这些结果暗示,长双歧杆菌耐酸菌株b.longumjdy1017dph可能通过调节与谷胱甘肽合成相关的氨肽酶n,从而使细胞内积累更多的谷胱甘肽以应对不利酸性环境;短双歧杆菌耐酸菌株b.brevebb8dph可能通过调节与胞外多糖合成相关的葡萄糖基转移酶从而增加细胞胞外多糖的含量以应对不利酸性环境,此结果从膜相关蛋白角度支持了在含吐温-80的mrsc液体培养基培养时,短双歧杆菌耐酸菌株B.breve BB8dpH具有其原始菌株B.breve更高的胞外多糖含量;短双歧杆菌耐酸菌株B.breve BB8dpH可能通过调节与谷氨酰胺转运相关的谷氨酰胺转运蛋白、糖原代谢相关的糖磷酸化酶增加细胞内谷氨酰胺和糖原含量以应对不利酸性环境,此结果从膜相关蛋白角度支持了RNA-seq测序结果得到的结论。此外,短双歧杆菌耐酸菌株B.breve BB8dpH可能通过调节寡肽转运、蛋白质合成以应对不利酸性环境。