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NLRP5、TLE6和PADI6基因属于皮质下母源复合体(SCMC)的成员,在卵子生长过程和植入前早期胚胎的发育中起到关键的作用。母源效应基因的研究主要在人和小鼠中,对于水牛这种大型家畜的母源效应基因的了解较少,并且在大型哺乳动物中母源效应基因的表达模式的调控机理研究也鲜有报道,再加生物制品市场上比较缺乏水牛母源基因抗体商品,难以对它们的功能和定位等机制进行深入研究。因此,制备水牛NLRP5、TLE6和PADI6多克隆抗体进一步研究其表达模式,对了解水牛卵母细胞生长及植入前早期胚胎发育机制提供一定的理论指导意义。本研究选取上述三个水牛母源效应基因为研究对象,展开了基因克隆、多克隆抗体制备和对其表达模式的研究。所得结果如下:1.克隆水牛母源效应基因NLRP5、TLE6和PADI6,结果表明,成功克隆得到水牛NLRP5基因的编码区(CDS)3297 bp完整的序列,由1098个氨基酸编码,预测分子量为121.17 k D;成功克隆了水牛TLE6基因编码区全长序列1731 bp,编码576个氨基酸,预测分子量为64.09 k D;克隆了水牛PADI6基因部分编码区序列2121 bp片段,与编码区2298 bp相比还缺177 bp,预测分子量为85.35 k D。序列分析显示克隆所得三个基因的核苷酸序列与牛、山羊和绵羊同源性较高,表明该三个基因在不同物种间进化具有保守性。分别对NLRP5、TLE6和PADI6三个蛋白进行结构及功能预测,结果提示,水牛NLRP5和TLE6可能与蛋白质之间的互作有关。2.构建水牛NLRP5、TLE6和PADI6原核表达载体及制备其多克隆抗体。将纯化后的重组蛋白分别免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,结果成功制备得到了多克隆抗体。通过Western blotting检测抗体与重组蛋白效价,结果上述三个基因的多克隆抗体效价分别达到1:64 000、1:64 000及1:512 000,表明多克隆抗体的效价较高。3.实时荧光定量PCR检测NLRP5、TLE6和PADI6三个基因在水牛卵母细胞及孤雌激活的早期胚胎各个时期表达模式,结果表明,其转录本在M II期卵母细胞中大量表达,随着不断卵裂而下降,在桑葚胚和囊胚期几乎检测不到表达;半定量PCR结果表明NLRP5在卵母细胞高量表达,在卵巢和睾丸微量表达,TLE6和PADI6仅在卵母细胞中表达;Western blotting技术对该三个蛋白在水牛组织中的表达模式进行分析,结果表明它们仅在卵母细胞中表达;免疫荧光检测NLRP5、TLE6和PADI6蛋白在卵母细胞成熟过程及各阶段早期胚胎中的表达模式,结果显示该三个母源蛋白在水牛卵母细胞成熟过程和早期胚胎发育到囊胚期都一直存在。综上所述,本试验成功构建了水牛NLRP5基因(480 bp)、TLE6基因(198 bp)和PADI6基因(504 bp)的原核表达载体并成功制备得到三个具备良好特异性的多克隆抗体,同时,通过检测与分析了解了三个母源基因和其相应的母源蛋白的表达模式。本试验为深入研究和了解水牛卵母细胞生长及其早期胚胎发育机制奠定了基础。