论文部分内容阅读
背景:近年来,在利用免疫系统治疗肿瘤方面取得了惊人的进展,免疫检查点的发现为肿瘤的治疗提供了新的思路。其中,T细胞表面的程序性死亡分子1(Programmed death 1,PD-1)和肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(Programmed deathligand 1,PD-L1)为一对重要的免疫检查点,阻断PD-1和PD-L1的结合已经成为当前肿瘤免疫治疗的研究热点。一些靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的抗体获得临床批准,并显示出了很好的临床活性,相对来说,小分子免疫检查点阻断剂因其在药代动力学特性、组织和肿瘤渗透性、以及生产成本等方面的天然优势,具有广阔的应用前景。到目前为止,仍没有靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂上市用于临床治疗。我们对天然产物来源的活性小分子化合物进行筛选,发现小檗碱(Berberine,BBR)可显著下调肺癌细胞中PD-L1蛋白的表达。虽然以往的研究表明BBR具有抗炎、抗菌、降血脂等药理活性,但其通过激活免疫系统发挥抗肿瘤作用的研究还未见报道。因此,我们对BBR阻断PD-L1的免疫抑制活性,通过调控肿瘤微环境杀伤肿瘤细胞的作用及其机制进行了研究。方法:以人非小细胞肺癌细胞为研究对象,通过MTT和流式细胞术等方法检测BBR对H460细胞增殖和凋亡的影响;利用流式细胞术,PD-1/PD-L1相互作用分析及Western blot的方法检测BBR对H460等细胞膜表面和细胞内PD-L1蛋白表达水平的影响;通过细胞阻抗分析、结晶紫实验检测共培养细胞的T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性;在C57BL/6J及BALB/C裸鼠Lewis肺癌移植瘤模型中检测BBR体内抑瘤活性;同时利用多色流式细胞仪检测BBR对肿瘤浸润性CD4+、CD8+T细胞、调节性T细胞(Regulatory T-lymphocytes,Tregs)和骨髓来源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)活性的影响,以及 γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)和颗粒酶B(Granzyme B,GzmB)含量的变化;采用免疫组化法检测BBR作用后肿瘤组织中PD-L1、cleaved caspase3、Ki67蛋白的变化,同时对小鼠肝、脾、肺、肾等主要脏器进行H&E染色;通过qRT-PCR的方法检测BBR对PD-L1 mRNA表达水平的影响;用生物素探针标记BBR后,通过Pull down实验确定BBR与CSN5相互作用;并通过表面等离子体共振实验(SPR)确定BBR和CSN5蛋白结合常数;利用去泛素化酶活性实验检测BBR对CSN5蛋白活性的影响;通过Discovery Studio软件分析BBR与CSN5结合位点,并结合点突变与免疫共沉淀实验确定BBR作用位点。结果:Western blot结果显示,BBR能明显下调H460等NSCLC细胞中组成型和诱导型PD-L1的表达,且对其他免疫检查点如CD47,IDO1的表达无明显影响。流式细胞术结果进一步证实BBR可以明显下调H157细胞膜表面PD-L1的表达。此外,BBR在20μM浓度内对细胞的毒性较小。PD-1/PD-L1结合实验结果表明,BBR可减少H460细胞与重组PD-1蛋白的结合。细胞阻抗实验和结晶紫染色结果显示,BBR可以增强共培养的T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。小鼠荷瘤实验证实,BBR可显著抑制C57BL/6小鼠中Lewis移植瘤的生长。4mg/kg和8mg/kg BBR处理荷瘤小鼠后,可使瘤体积分别减少46.8%和75.8%,同时激活荷瘤小鼠肿瘤浸润性T细胞的杀伤活性。BBR可使杀伤性CD8+T细胞数量增加,并促使其分泌肿瘤杀伤性细胞因子IFN-γ和GzmB。同时,BBR可以抑制MDSCs和Tregs细胞在肿瘤中的聚集。以上结果表明,BBR可使Lewis荷瘤小鼠的抑制性肿瘤微环境转变为激活性肿瘤微环境。此外,BBR对BALB/C裸鼠Lewis移植瘤无明显的抑制作用,进一步证实BBR的抑瘤作用是通过激活免疫作用实现的。免疫组化结果显示,BBR可使小鼠肿瘤组织中PD-L1和Ki67表达降低,凋亡指示蛋白cleaved caspase3增加,且BBR对小鼠肝、脾、肺、肾等主要脏器无明显的毒性。机制研究发现,BBR对PD-L1转录水平无明显影响,而是通过作用于泛素-蛋白酶体途径促进PD-L1发生泛素化降解。链霉亲和素pull down实验发现BBR与去泛素化酶CSN5存在直接相互作用,SPR方法测得BBR与CSN5的结合常数为16.25μM。点突变与免疫共沉淀实验发现,BBR选择性结合于CSN5去泛素化酶的76位谷氨酸,通过抑制CSN5的去泛素化酶活性导致PD-L1发生泛素化降解,进而激活肿瘤浸润T细胞活性。结论:我们的研究结果揭示了 BBR通过调控肿瘤微环境中CD8+T细胞活性从而发挥其抗肿瘤活性的一个新机制。BBR可直接结合到肿瘤细胞中CSN5蛋白上并抑制其去泛素化酶的活性,促进PD-L1发生泛素-蛋白酶体途径降解,进而激活肿瘤微环境中CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。本研究为将BBR发展成为一个新的肿瘤免疫治疗小分子药物提供了重要的物质基础与科学依据。