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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是目前全球养猪业面临的最大困扰之一,由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起。该病毒具有变异度高,变异速度快的特点,该病的蔓延给全球养猪业造成了难以估量的损失,有效防控猪繁殖与呼吸综合征对养猪业的健康发展十分重要。PRRSV亚基因组RNA(sg RNA)的转录过程是不连续的,转录过程中会形成一系列具有相同5’和3’末端的亚基因组sg RNA。从PRRSV这一特殊的转录机制入手,或许会为PRRSV防控找到新思路。目前发现PRRSV的转录过程由基因组中众多的转录调控序列(Transcriptional regulatory sequence,TRS)调控,包括位于5’UTR中的Leader-TRS和位于基因组内的Body-TRS。根据地域分布的不同和基因差异,PRRSV被分为两种基因型,分别是欧洲型(I型)和美洲型(II型)。两种基因型的PRRSV不仅核酸同源性低,而且在存在着明显的地域分布差异。利用反向遗传技术及高通量测序技术,在实验室前期对美洲型HuN4毒株研究的基础上,以本实验室保存的欧洲型PRRSV分离株LLV-1毒株为研究对象,从转录机制入手分析欧、美毒株转录调控差异。研究,获得以下结果:(1)成功建立了欧洲型PRRSV LLV-1毒株的反向遗传平台。将实验室保留的欧洲型PRRSV LLV-1的两个基因片段,利用限制性内切酶San D I和Xba I作为桥梁,连接入载体pc DNA3.1,获得包含LLV-1全基因的重组质粒pc DNA3.1-LLV,将该质粒转染BHK-21后48 h,转接Marc-145细胞,盲传3代,可见接种细胞出现细胞病变,经RT-PCR鉴定,能够从细胞上清中扩增到PRRSV GP5基因,证明成功拯救欧洲型PRRSV LLV-1。(2)解析欧洲型PRRSV sg RNA转录特点。收集LLV-1毒株感染Marc-145细胞及PAM细胞48 h后的样品进行高通量测序,对结果进行分析,发现PRRSV LLV-1基因组中有163个有效的B-TRS位点;构成B-TRS序列的6个碱基可以是任意组合,但更倾向TTAACC的组合;与L-TRS的组成相似度越高,其介导的sg RNA转录丰度也越高。对各ORF内B-TRS的数量及其转录丰都进行统计,结果显示ORF2-7转录子在两种细胞内转录比例基本相同。比较Marc-145和PAM细胞中各转录子丰度,在Marc-145细胞内病毒转录子丰度比为3.4:1:3:4.3:7.3:35.8,PAM细胞中病毒转录子丰度比为3.3:1:2.8:3.7:7.9:30.1。与美洲型PRRSV HuN4比较,两种基因型在ORF3的转录比例上呈现显著差异,美洲型中ORF3转录子的丰度与ORF2、ORF4基本持平,欧洲型中ORF3的转录丰度明显低于ORF2与ORF4的转录丰度。LLV-1在Marc-145细胞中各转录子转录丰度较高,而HuN4毒株在PAM细胞内转录子丰度更高,提示HuN4对PAM细胞有着较高的适应性。(3)成功构建欧美嵌合型毒株LLV-1-HuN4s。借助同源重组技术将LLV-1基因组中结构蛋白基因(ORF2-ORF6)序列用美洲型PRRSV HuN4毒株对应的结构蛋白序列替换,并成功拯救出嵌合病毒。对嵌合病毒增殖量和细胞因子IL-8、IL10进行检测,嵌合毒株在Marc-145细胞中的增殖量与增殖趋势与HuN4毒株和LLV-1毒株相近,同时PAM细胞中细胞因子IL8、IL-10的表达量与转录趋势也与HuN4和LLV-1毒株相近。证明嵌合病毒具有和亲本毒株相似的增殖特性,美洲型病毒蛋白可以在欧洲型PRRSV基因上正常发挥功能,欧美毒株具有潜在的重组可能性。(4)分析了欧洲型PRRSV稳定的基因插入位点。选取ORF7和3’UTR之间及ORF1b及ORF2a间的位置作为外源蛋白基因插入位点,以GFP为靶基因,拯救病毒,RT-PCR检测分析GFP基因转录情况。结果显示GFP插入的这两个位点,稳定性都较差,外源基因在第三到四代时发生丢失。相对插入ORF1b及ORF2a间,将GFP插入在3’UTR之前更稳定。RT-PCR检测结果显示GFP插入ORF7与3’UTR之间时表达量高于插入ORF1b与ORF2a之间。(5)分析欧美毒株B-TRS引导外源基因表达的差异。为增加外源基因表达的稳定性,在ORF7与3’UTR之间分别插入带有欧、美毒株TRS6及其侧翼序列的GFP,以单独引入GFP基因做对照,拯救病毒,并经RT-PCR检测GFP m RNA转录量。结果显示,在外源基因前插入美洲株B-TRS及其侧翼序列的重组病毒,外源基因表达稳定性最高,至少可以稳定传至第6代。综上所述,本文成功建立欧洲型PRRSV反向遗传平台,比较分析了欧、美洲型PRRSV转录特点,初步证明美洲PRRSV在PAM细胞内具有更高的亚基因转录丰度。构建了欧美嵌合型毒株,证明美洲型毒株结构基因可以在欧洲型PRRSV内正常发挥功能,说明两者具有潜在的重组能力。分析了欧洲型PRRSV作为外源基因表达载体时不同插入位点插入基因稳定性,并证实美洲型PRRSV B-TRS6在欧洲型PRRSV基因组内具有更好的引导外源基因表达的作用。