胰岛素抵抗是肥胖导致的代谢综合征的典型表现，因其作用器官广泛和作用机制复杂成为糖尿病等代谢性疾病治疗中的一大难题。胰岛素生物学功能的发挥有赖于其信号通路中各个信号转导分子的顺序激活，任何一种蛋白分子的抑制或降解，均会导致机体出现糖脂代谢紊乱等胰岛素抵抗现象。胰岛素抵抗发病机制呈现出极其复杂的作用网络，包括多个信号通路与胰岛素信号通路的交互作用及多种调控因子的广泛参与，因而明确各相关信号通路及调控因子与胰岛素信号通路的具体作用方式，对于阐明胰岛素抵抗发病机制至关重要。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)是机体蛋白质降解的主要途径，可选择性地参与细胞内80％以上蛋白质的降解，与胰岛素信号通路的正常转导关系密切。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类近年来备受关注的新型高效调控分子，能直接靶向调控胰岛素及其相关信号通路的蛋白分子，直接或间接诱发机体胰岛素抵抗。目前，关于胰岛素信号通路、UPS和miRNAs三者之间是否存在交互作用尚无报道。　　课题组前期通过基因芯片法筛选出高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠肝脏组织mmu-miR-7a-5p显著下调，经靶基因预测软件TargetScan和miRDB分析证实，mmu-miR-7a-5p与人类hsa-mir-7-5p同源性可达100％，故本研究建立人肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗模型，检测胰岛素抵抗状态下miR-7-5p的差异表达，研究其与预测靶基因E3泛素连接酶ITCH的靶向作用关系，探讨miR-7-5p和Itch基因与胰岛素抵抗的相关性，以丰富胰岛素抵抗的机制，为进一步深入研究miR-7-5p和Itch基因的生物学作用、寻找诊断和治疗胰岛素抵抗的分子靶点提供实验依据。　　首先，实验采用适宜浓度的软脂酸(palmitic acid，PA)诱导HepG2细胞，建立体外胰岛素抵抗模型，运用实时荧光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）技术检测胰岛素抵抗状态下miR-7-5p的表达差异。结果表明，当0.25 mmol/L PA作用于HepG2细胞24 h后，细胞活性较好，对葡萄糖利用率降低，胞质内脂质堆积增加，是诱发HepG2细胞产生胰岛素抵抗的最适宜浓度。HepG2细胞在胰岛素抵抗状态下，miR-7-5p表达下调近2倍，差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示miR-7-5p可能参与了HepG2细胞胰岛素抵抗过程。　　其次，进行生物信息学分析，使用Targetscan数据库和miRDB数据库联合预测miR-7-5p的靶基因，KEGG数据库分析miR-7-5p的预测靶基因可能富集的生物学信号通路，利用STRING10.0软件进行被预测靶基因与胰岛素信号通路相关蛋白的相互作用分析，以确定与胰岛素抵抗最为相关的靶基因。结果表明，miR-7-5p有相当数量的靶基因富集于UPS，其中E3泛素连接酶ITCH可与磷脂酰肌醇激酶催化亚基α亚基(Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphonate3-kinase，catalyticsubunit，alpha polypeptide gene，PIK3CA)直接相互作用，降低胞内磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)的p110催化亚基的生成，直接影响胰岛素信号通路重要分支PI3K-蛋白激酶B(proteinkinase B，AKT或PKB)通路的正常转导。　　再次，为了证实miR-7-5p与Itch基因两者表达之间是否存在相关关系，运用RT-qPCR和Western blot技术分别检测在胰岛素抵抗状态下其预测靶基因Itch转录及翻译水平的表达变化。结果表明，Itch基因在胰岛素抵抗状态下，其转录水平的表达量与正常对照组无显著差异(P＞0.05)，但翻译水平的表达量比正常对照组上调，差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明胰岛素抵抗状态下miR-7-5p与Itch基因表达存在负相关关系。　　最后，为了进一步验证两者之间的靶向作用关系，首先，体外转染适宜浓度的miR-7-5p inhibitor，抑制HepG2细胞内miR-7-5p的表达，分别采用RT-qPCR和Western blot技术再次检测Itch基因转录及翻译水平的表达差异，以初步探讨两者之间的靶向作用关系;其次，构建pmirGLO-Itch-3UTR野生型载体和pmirGLO-mut-Itch-3UTR突变型载体，与miR-7-5p mimics共转染Hela细胞，根据萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性的比值变化，判断两者之间是否存在直接靶向作用关系。结果表明:HepG2细胞转染200 nM miR-7-5p inhibitor后，miR-7-5p的表达量下调2倍以上，而Itch基因则在翻译水平表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示miR-7-5p可能与Itch mRNA的3-非翻译区（3-untranslated region，3-UTR）种子序列结合，在翻译水平影响ITCH蛋白表达，从而参与胰岛素抵抗的发生与发展。双萤光素酶报告基因检测结果表明，miR-7-5p组与阴性对照组相比，转染有pmirGLO-Itch-3UTR野生型载体的细胞，其萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性的比值明显下调，差异具有统计学意义(P＜0.05);转染有pmirGLO-mut-Itch-3UTR突变型载体的细胞，其比值无显著性差异(P＞0.05)，说明Itch基因是miR-7-5p直接作用的靶基因，miR-7-5p可结合于Itch基因的3UTR，在翻译水平抑制基因表达。　　综上，在HepG2细胞胰岛素抵抗模型和生物信息学分析的基础上，通过RT-qPCR、Western blot、细胞转染和双萤光素酶报告基因等实验，初步阐明了miR-7-5p和Itch基因的靶向作用及其与胰岛素抵抗的关系，表明miR-7-5p可能参与了胰岛素抵抗的病理生理过程，其机制可能通过靶向调控Itch基因表达，直接影响胰岛素重要信号通路PI3K-AKT的正常转导，诱发胰岛素抵抗。