烧伤是以皮肤损伤为始发因素的特殊类型创伤，其主要问题是创面问题，如何尽早封闭、修复创面是烧伤治疗的根本任务。创面修复是现代医学研究的重要领域，表皮干细胞（Epidermal Stem Cell,ESC）是皮肤创面自行或生理性愈合的最重要物质基础^[1]。表皮干细胞通过其表达的整合素（integrin）等与皮肤组织细胞外基质（ESC）如胶原、层粘蛋白等结合，而固定于基底层或毛囊外鞘隆突等特定微环境或称为壁龛（niche）的巢穴中，并发现这是维持其干细胞特性的必要条件。现有研究表明，残存、健在的皮肤表皮干细胞在创面的生理性愈合中起着重要作用。残存的表皮干细胞通过脱粘附、离巢迁移、增殖，并向表皮终末细胞分化，形成表皮角质细胞，向创面爬行，进而覆盖创面，最终封闭修复创面。但对于引起表皮干细胞脱粘附、离巢迁移、增殖、分化的因素及其机制目前仍不清楚。研究表明，一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一种作用众多小分子生物活性介质，参与了多种病理及生理过程。并有研究发现， NO在创面愈合过程中的炎症反应、肉芽组织增生及创面重塑中均起着重要作用。它既具有收缩创面、扩张血管、参与炎症反应、抗感染能力，以及促进胶原合成、血管新生、成纤维细胞增殖、增强创面抗张强度（wound breaking strength）等。有文献报道，烧伤早期创面局部有较高浓度的NO，其产生时间与烧伤后ESC离巢迁移时间相重叠^[2]。有研究发现，在小鼠二度烧伤模型中外源性NO可显著促进烧伤创面的愈合；在气道上皮细胞的体外创伤模型中发现，低浓度NO可促进上皮细胞的迁移与创面修复。我们前期实验表明：NO能够促进HaCat细胞的迁移^[3]，其部分作用机制为：一方面，通过增加细胞内cGMP的浓度，使RhoGTPase活性增强，表达增高，细胞骨架出现相应的改变，增强了细胞迁移的动力；另一方面，通过降低β1-整合素的表达，抑制细胞的粘附能力，减少迁移的阻力。因而我们推测，NO可能在ESC脱粘附、离巢迁移过程中起着重要作用。目的探讨烧伤后外源性一氧化氮（NO）对表皮干细胞在创面修复中离巢迁移中的作用，为进一步完善创面修复的基础理论和临床应用指导打下基础。方法1、一氧化氮对体外培养人表皮干细胞粘附、迁移及增殖功能的影响（1）人表皮干细胞分离培养与鉴定：参照Bickenbach^[4]等的Ⅳ型胶原快速黏附法并进行改良，分离纯化培养人ESC。操作如下：取术毕弃用包皮消毒后加入中性蛋白酶Ⅱ于4℃过夜；次日分离表皮、真皮，将表皮剪碎并以2.5g/L胰蛋白酶于37℃消化10min；终止消化后过滤、离心、收集细胞并计数。以K-SFM培养液调整细胞浓度为（1²）×10⁶个细胞/25cm²，接种于100μg/mL Ⅳ型胶原包被过夜的培养瓶中,常规培养10min，吸弃未贴壁细胞，PBS轻洗2次，更换新的K-SFM培养液常规培养，次日换液，此后每3天换液1次。采用倒置相差显微镜观察细胞生长及形态变化情况。60%⁷0%细胞融合时，采用2.5g/L胰蛋白酶-0.1g/L乙二胺四乙酸消化2min且按1:2传代。取第2代分离培养细胞完成West Blotting、细胞免疫荧光染色法检测分离培养细胞中β1整合素和ck19蛋白的表达；流式细胞仪检测分离培养细胞a₆^briCD71^dim阳性率。（2）划痕实验检测NO对ESC体外迁移功能的影响：将取第2代分离培养细胞制成单细胞悬液1.5×10⁵个/mL，接种于Ⅳ型胶原包被过夜的24孔板，每孔接种1mL，常规培养24h，采用含终浓度为4μg/mL丝裂霉素的K-SFM培养液培养2h^[5]。参照Castilho^[6]的方法进行细胞迁移功能检测：用10μL枪头垂直于培养板孔底划痕，PBS清洗2次，分别加入含终浓度为0（对照）、1、10、100、500μmol/L SNAP溶液的K-SFM培养液，置入培养箱中于划痕后12、24h观察拍照，各浓度设定3个复孔。采用ImageJ图像分析软件（美国卫生研究所）计算细胞迁移率=（原划痕宽度－各时相点划痕宽度）÷原划痕宽度×100%。（3） Transwell实验检测NO对ESC趋化能力的影响：在Transwell板（24孔，孔径为8μm）^[7]下室加入含上述浓度SNAP溶液的K-SFM培养液（600μL/孔），各浓度3个复孔；将取第2代分离培养细胞制成单细胞悬液（浓度为4×10⁵个/mL）接种于Transwell上室，每孔接种100μL。常规培养24h，PBS清洗2次，4℃下甲醇固定20min，1g/L结晶紫染色15min，PBS冲洗多次，倒置显微镜下转膜、拍照、每个复孔选取5个视野计数下室细胞，并进行统计分析。（4）黏附实验检测NO对ESC黏附功能的影响：参照文献^[8]方法进行如下操作。采用含终浓度为0（对照）、10、100、500μmol/L SNAP溶液的K-SFM培养液调整细胞悬液浓度为5×10⁵个/mL；于37℃采用3g/L BSA封闭Ⅳ型胶原包被过夜的96孔板2h，PBS清洗3次。将细胞悬液接种于96孔板，每孔200μL，各浓度设6个复孔。常规培养1h，PBS清洗3次；加入含体积分数10%CCK-8的K-SFM培养基（100μL/孔），常规培养4h，酶标仪测定波长450nm处的吸光度值（代表黏附细胞数）。细胞黏附抑制率=（0μmol/L SNAP作用细胞的吸光度值－各浓度SNAP作用细胞的吸光度值）÷0μmol/L SNAP作用细胞的吸光度值×100%，进行统计分析。（5） NO对ESC增殖功能的影响：参照Fujisaki^[9]方法进行如下操作：将取第2代分离培养细胞制成单细胞悬液以3×103/孔接种于Ⅳ型胶原包被过夜的96孔板，培养3d后分别加入含终浓度为0（对照）、10、100、500μmol/L SNAP的K-SFM培养液，各浓度设6个复孔，常规培养；于SNAP作用0（即刻）、12、24、48、72h更换含体积分数10%CCK-8的K-SFM培养基（100μL/孔），常规培养4h；酶标仪测定波长450nm处的吸光度值（代表孔内细胞数）。2、一氧化氮影响烧伤后在体表皮干细胞迁移的实验研究（1）小鼠浅二度烫伤模型的制备：实验动物健康7周龄15-18g成年C57bl/6小鼠24只，烫伤仪器采用恒温恒压烫伤仪，烫伤时间均为3s，烫伤温度为0℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃（各温度下3只实验动物），致伤压力为烫伤棒自重0.5kg，烫头面积2cm2。致伤部位：小鼠两后腿中间部背部。烫伤后24h取创面组织行病理组织学观察。根据病理组织学观察结果筛选浅二度的创面致伤温度。（2） BrdU在体标记小鼠表皮干细胞：新生第3天C57bl/6小鼠消毒后腹腔注射BrdU50mg/kg体重，一天两次，连续注射3天；母乳继续饲养；分别于注射BrdU后1天、2周、3周、4周、5周、6周、7周取小鼠两后腿中间部背部皮肤并进行石蜡包埋；免疫荧光组织化学和免疫组织化学检测BrdU在表皮中的代谢及分布变化。（3）一氧化氮影响烧伤后表皮干细胞迁移的实验研究：新生第3天C57bl/6小鼠腹腔注射BrdU后7周（方法同前）；分组腹腔注射：L-精氨酸、L-NMMA、等体积生理盐水及甘氨酸（每组五只小鼠）；进行浅二度烫伤（方法同前）后单笼饲养48h取材并进行石蜡包埋；免疫组织化学检测BrdU在再表皮中阳性数；BrdU在再表皮中阳性数代表表皮干细胞的迁移能力，进行统计分析。结果1、使用中性蛋白酶和胰酶两步消化结合Ⅳ型胶原快速粘附法获得的表皮干细胞形态均一，核浆比大，表现出早期幼稚细胞的形态特征，细胞呈典型大克隆的“铺路石”样生长；2、ESCs鉴定实验中，蛋白质印迹法显示分离的细胞均能表达CK19和整合素β1蛋白条带；细胞免疫荧光化学体外培养的表皮干细胞表面标记物K19、β1-integrin呈强阳性表达；流式细胞仪技术检测表皮干细胞表达a₆^briCD71^dim百分率为56.52%；3、体外创伤划痕实验中随着SNAP浓度的升高（0¹00μmol/L），划痕后12、24h细胞迁移率均逐渐增加。划痕后24h，100μmol/L SNAP作用细胞的迁移率显著高于0μmol/L SNAP作用细胞的迁移率（F=27.90，P<0.01）；500μmol/L SNAP作用细胞的迁移率显著低于0μmol/L SNAP（F=65.43，P<0.01）。表明100μmol/L的SNAP处理ESC24小时是促进细胞迁移的较佳作用浓度和时间。4、Transwell实验发现不同SNAP浓度作用下对ESC的趋化作用中，100μmol/L的SNAP处理组与对照组相比转膜细胞数显著增多（P<0.05）。5、粘附实验表明，在（10-1000）μmol/L SNAP作用24小时对ESC具有线性脱粘附作用，且100μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L SNAP对ESC的脱粘附作用具有显著性差异（P<0.05）。6、增殖实验发现，在（1-100）μmol/L SNAP作用在不同时相点对ESC均有促增殖作用，且100μmol/L SNAP对ESC的增殖作用最为显著性（P<0.05）。7、通过超衡温烫伤仪控制烫伤温度为65℃和时间为3s可建立成年C57bl/6小鼠浅二度烫伤模型；8、BrdU滞留实验中组化结果发现，注射BrdU1天时皮肤中所有细胞BrdU均呈不同程度的阳性表达；随着时间推移，BrdU在皮肤细胞核中的表达逐渐减弱、减少；6周以后阳性细胞主要分布于毛囊隆凸部；9、在体ESC迁移实验中发现，再生表皮中BrdU阳性细胞数L-精氨酸组及L-NMMA组与生理盐水组均有显著性差异，L-精氨酸组较L-NMMA组显著增多。结论：通过本研究，我们发现：1、外源性NO对体外培养人ESC具有脱黏附、促增殖作用；适宜浓度的外源性NO对体外培养人ESC的迁移功能有促进作用；2、通过在体BrdU滞留法发现，烧伤后外源性NO可能通过促进ESC脱粘附、离巢迁移、促增殖等而促进创面愈合。