泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specific proteases,USPs)属于去泛素化酶(DUBs)的五大家族之一,种类达54种之多,其中许多成员与恶性肿瘤的发生、发展过程密切相关,如:前列腺癌(USP2)、恶性腺瘤(USP4)、白血病(USP9x)及胶质母细胞瘤(USP15)等。因此,目前多项研究着眼于分析USP与肿瘤的相关性,以寻找新的恶性肿瘤靶向治疗的有效途径。泛素特异性蛋白酶12(ubiquitin-specific protease 12,USP12)作为USPs家族中成员,含有1113个碱基,编码370个氨基酸,分子量为43KDa。目前多个研究发现USP12通过发挥其去泛素化功能,在前列腺癌、结肠癌、人类上皮性癌等肿瘤的发生、发展过程中起着促癌或抑癌的作用。宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,多项研究证实宫颈癌的发生发展与泛素化或去泛素化过程密切相关(P53的泛素化,真核翻译起始复合物3(eIF3I)蛋白的泛素化以及USP19的去泛素化等),但是USP12对宫颈癌的作用以及其作用机制目前还未见报道。本研究证实USP12可以调节HeLa细胞(宫颈癌细胞)细胞周期进程,而且这一调控作用依赖于其去泛素化酶活性。此外,我们也进一步探讨了能够影响USP12酶活性的蛋白结构区域,旨在为宫颈癌的分子靶向治疗提供更多依据。第一部分:泛素特异性蛋白酶12基因沉默对Hela细胞凋亡及细胞周期的影响目的:USP12除了与底物蛋白在细胞内的定位,组蛋白H2A与H2B的去泛素化以及非洲爪蟾的发育过程相关外,还通过多种细胞通路,参与调节前列腺癌细胞、结肠癌细胞、C33A细胞(HPV阴性的人宫颈癌细胞)等多种肿瘤细胞的凋亡或细胞周期,但其与宫颈癌细胞HeLa细胞的关系如何目前还知之甚少。本研究拟敲除HeLa细胞中的USP12基因,观察其对HeLa细胞凋亡和细胞周期的影响,进一步了解USP12与宫颈癌的关系。方法:1将usp12的三条特异性sirna转染至hela细胞,72小时后收集细胞,提取细胞总rna和总蛋白,利用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)及westernblot的方法检测usp12mrna水平和蛋白水平的表达情况,筛选具有最佳沉默效果的usp12sirna。接着,将usp12的sirna-3转染至hela细胞,分别于不同时间点(24小时、48小时、72小时)收集细胞,提取细胞内的总rna和总蛋白,利用qrt-pcr及westernblot的方法检测usp12mrna水平和蛋白水平的表达情况,以确定usp12sirna的最佳沉默时间点。2观察usp12基因沉默对hela细胞凋亡和细胞周期进程的影响:将usp12sirna-3及对照negativecontrol-sirna转染至hela细胞,48小时后收集细胞,70%乙醇过夜固定,再利用流式细胞术检测分析细胞的凋亡情况和细胞周期的分布。3检测usp12基因沉默对细胞周期相关因子的影响:将usp12sirna-3及对照negativecontrol-sirna转染至hela细胞,48小时后收集细胞,提取细胞总rna,并采用qrt-pcr的方法检测bmi-1,c-myc和cyclind2因子的转录水平。结果:1hela细胞中usp12sirna的基因沉默效果:qrt-pcr结果显示,在hela细胞中,转染72小时后,与对照组相比,usp12的三个sirna转染组usp12mrna水平均明显下降(*p<0.05),其中usp12sirna-3的沉默效果最强(#p<0.05),而且usp12sirna-3在48小时沉默效果最好。westernblot的检测结果与qrt-pcr一致。2usp12基因沉默对hela细胞凋亡和细胞周期的影响:流式细胞术检测usp12与hela细胞凋亡的关系,结果显示:敲除hela细胞中usp12基因48小时后,对照组与usp12基因沉默组细胞凋亡率分别为4.03%±0.330%以及4.32%±0.324%,两者无统计学差异。而对细胞周期的检测发现,与对照组相比,usp12基因沉默组g0/g1期的细胞从60.7%±0.839%升高至72.1%±2.61%,差别有统计学意义,表明usp12基因沉默可以将hela细胞周期阻滞在g0/g1期,从而抑制细胞增殖。3usp12基因沉默对细胞周期相关因子的影响:提取各组hela细胞总rna后,qrt-pcr结果显示,usp12基因沉默组与对照组相比,bmi-1,c-myc及cyclind2的mrna水平都有下调,差异均有统计学意义,表明usp12可能是通过bmi-1和c-myc/cyclind2途径正向调节hela细胞周期的进程,进而实现对细胞增殖的调控作用的。结论:1hela细胞中,usp12sirna-3在48小时沉默效果最好,mrna水平和蛋白水平的检测结果一致。2流式细胞术检测结果表明,hela细胞的凋亡并不受usp12的影响,但usp12的基因沉默可以导致hela细胞发生g0/g1期细胞周期阻滞,从而抑制细胞增殖。3usp12可能是通过bmi-1和c-myc/cyclind2途径正向调节hela细胞周期的进程,进而通过上述作用调控hela细胞增殖的。第二部分:泛素特异性蛋白酶12基因错义点突变与其去泛素化酶活性的关系目的:第一部分实验证实了usp12表达量变化对hela细胞周期进程具有调控作用,但是usp12去泛素化酶活性的变化是否会对hela细胞凋亡及细胞周期产生影响目前尚不清楚。因此,除去本课题组之前已经构建的usp12(c48s)与usp12(h173d)突变体外,本部分研究参照ncbi数据库拟另外构建7个usp12基因错义突变体并分析它们的酶活性变化情况,以便后续深入了解点突变后usp12酶活性改变对hela细胞凋亡及细胞周期的影响。方法:1usp12突变质粒的构建:以本室之前已构建的pgex-usp12(wt)质粒为模板,采用定点突变pcr的方法构建构建pgex-usp12(v7i,r61h,a69g,r152h,l153s,r237c以及n314s)质粒,并进行测序鉴定。然后用以上质粒和本课题组之前已经构建的pgex-usp12(c48s)与pgex-usp12(h173d)质粒为模板,采用限制性内切酶(双酶切)将编码相应usp12基因的dna片段切下并插入至pac-t7载体的bamhi酶切位点,构建pac-t7-usp12野生型及各突变型质粒。2采用ub-met-β-gal和gst-ub52两种模型底物检测系统检测usp12野生型和usp12(c48s),usp12(v7i),usp12(r61h),usp12(a69g),usp12(r152h),usp12(l153s),usp12(h173d),usp12(r237c)以及usp12(n314s)九个突变体的去泛素化酶活性,并用odyssey双色红外激光成像系统分析usp12各突变体与其野生型的酶活性差异。结果:1usp12突变质粒的构建:测序结果证实,pgex-usp12各突变型质粒在其预期位点均成功发生定点突变:19g>a突变引起v7i氨基酸改变,182g>a突变引起r61h氨基酸改变,206c>g突变引起a69g氨基酸改变,455g>a突变引起r152h氨基酸改变,458t>c突变引起l153s氨基酸改变,709c>t突变引起r237c氨基酸改变,以及941a>g突变引起n314s氨基酸改变。另外,以pgex-usp12野生型和各突变型质粒为模板,利用双酶切方法将编码相应usp12基因的dna片段切下并插入至pac-t7载体后,根据正反鉴定结果,筛选出了正向插入的pac-t7-usp12重组质粒,表明usp12野生型和各突变型质粒换载成功。2usp12的9种错义突变对其去泛素化酶活性的影响:模型底物ub-met-β-gal检测体系中,usp12(c48s)和usp12(h173d)为失活突变体,不能将模型底物ub-met-β-gal切断,没有产生met-β-gal蛋白条带,这与本课题组前期的研究结果一致。usp12野生型和其他突变体都具有去泛素化酶活性,能切断模型底物,产生预期的met-β-gal条带。通过进一步的半定量分析,发现usp12突变体中usp12(l153s)和usp12(r237c)去泛素化酶活性增强,分别增加至野生型的275%±32.6%和158%±11.2%,差异有统计学意义。而usp12(v7i),usp12(r61h),usp12(a69g),usp12(r152h)以及usp12(n314s)几个突变体的酶活性与野生型相比没有改变。模型底物gst-ub52检测体系中,usp12(c48s)为失活突变体,不能将gst-ub52切断,产生预期的36kda的gst-ub条带,这与ub-met-β-gal检测体系结果一致。usp12野生型和其他突变体都具有去泛素化酶活性,能切断模型底物,产生预期的gst-ub条带。通过进一步的半定量分析,发现usp12其他各突变体与其野生型相比,去泛素化活性相似,usp12(l153s),usp12(h173d)和usp12(r237c)均未像ub-met-β-gal系统一样检测到去泛素化酶活性的变化。结论:1本部分研究成功构建了7个usp12基因错义突变体usp12(v7i),usp12(r61h),usp12(a69g),usp12(r152h),usp12(l153s),usp12(r237c)以及usp12(n314s)。2usp12的c48s突变会导致其失活,usp12(h173d)在ub-met-β-gal酶活性检测系统中活性消失,但在gst-ub52检测体系中活性没有改变。另外,以ub-met-β-gal为作用底物时,usp12发生l153s和r237c点突变后,其去泛素化酶活性升高。usp12的其余5个snp突变均未能对其去泛素化酶活性产生影响。第三部分:泛素特异性蛋白酶12点突变体酶活性改变对hela细胞凋亡和细胞周期的影响目的:前面的研究已经证实usp12表达量的变化能够影响hela细胞的细胞周期进程,为了深入探讨usp12去泛素化酶活性变化对hela细胞凋亡和细胞周期的影响,根据第二部分实验结果,拟构建pegfp-usp12(wt),pegfp-usp12(c48s),pegfp-usp12(l153s)以及pegfp-usp12(r237c)质粒,观察它们对hela细胞凋亡、细胞周期的调控效果,旨在深入了解usp12的作用机制,为宫颈癌的分子靶向治疗提供依据。方法:1pegfp-usp12野生型和各突变型质粒的构建:选取有活性变化的usp12突变体,分别以pgex-usp12(wt),pgex-usp12(c48s),pgex-usp12(l153s)和pgex-usp12(r237c)为模板,通过双酶切(限制性内切酶bamhi和sali)将编码相应usp12基因的dna片段切下并插入至pegfp-c1载体质粒中,构建pegfp-usp12(wt),pegfp-usp12(c48s),pegfp-usp12(l153s)以及pegfp-usp12(r237c)质粒,并进行正反鉴定。2检测usp12去泛素化酶活性的改变对hela细胞凋亡和细胞周期的影响:将pegfp-usp12野生型和各突变型质粒以及对照质粒pegfp-c1分别转染至hela细胞中,48小时后收集细胞,70%乙醇过夜固定,再用流式细胞术检测分析各组细胞的凋亡及细胞周期的分布情况。3检测usp12去泛素化酶活性的变化对细胞周期相关因子的影响:将pegfp-usp12野生型和各突变型质粒以及对照质粒pegfp-c1分别转染至hela细胞中,48小时后收集细胞,提取细胞总rna,并采用qrt-pcr方法检测各组bmi-1,c-myc和cyclind2因子的转录水平。结果:1pegfp-usp12野生型和各突变型质粒的构建:根据酶切正反鉴定结果,我们成功筛选出了正向插入的pegfp-usp12(wt),pegfp-usp12(c48s),pegfp-usp12(l153s)以及pegfp-usp12(r237c)重组质粒,表明pegfp-usp12野生型和各突变型质粒构建成功。2usp12去泛素化酶活性的改变对hela细胞凋亡和细胞周期的影响:流式细胞术检测结果显示,将pegfp-c1,pegfp-usp12(wt),pegfp-usp12(c48s),pegfp-usp12(l153s)以及pegfp-usp12(r237c)分别转染至hela细胞48小时后,各实验组hela细胞凋亡率与对照组比较,均无明显改变,差异无统计学意义。而检测各组细胞周期的分布情况发现:与对照组相比,usp12(wt)和usp12(l153s)能够促进细胞周期的进程,两组处于g0/g1期的细胞均减少,处于s期的细胞均增加,而且l153s组的改变更为明显。pegfp-usp12(r237c)对hela细胞周期的调控效果与野生型一致。与对照组相比,usp12(c48s)组细胞周期进程无明显改变,差异无统计学意义。3usp12去泛素化酶活性的变化对细胞周期相关因子的影响:将pegfp-c1,pegfp-usp12(wt),pegfp-usp12(c48s),pegfp-usp12(l153s)以及pegfp-usp12(r237c)分别转染至hela细胞48小时后,提取细胞总rna,qrt-pcr检测细胞周期相关因子的mrna水平,结果发现:与对照组相比,usp12(wt)及usp12(l153s)组bmi-1,c-myc及cyclind2的转录水平都有上调,而且usp12(l153s)活性增强突变体对以上因子的调控作用更为明显。除了bmi-1,usp12(r237c)与野生型相比,对c-myc及cyclind2在转录水平的调控作用一致。pegfp-usp12(c48s)组以上三个因子的mrna水平与对照组相比,没有统计学差异。1本部分研究成功构建了pegfp-usp12(wt),pegfp-usp12(c48s),pegfp-usp12(l153s)和pegfp-usp12(r237c)质粒。2hela细胞凋亡情况并未受usp12的去泛素化酶活性变化的影响,但是usp12对其细胞周期的调控作用呈现出了去泛素化酶活性依赖性。3在hela细胞中,usp12去泛素化酶活性的改变能够影响bmi-1,c-myc及cyclind2的mrna水平,提示usp12活性改变对hela细胞周期的调控作用可能是通过细胞周期相关因子bmi-1,c-myc及cyclind2实现的。第四部分:泛素特异性蛋白酶12多位点突变与其去泛素化酶活性的关系目的:前面的研究发现,以ub-met-β-gal为作用底物时,在usp12的三个跟酶催化活性有关的保守结构域(cys、asp及his区域)之外,其他区域的点突变也能影响usp12的去泛素化酶活性。近来的研究证实,某些泛素特异性蛋白酶位于保守催化活性结构域之外的区域也跟它们的去泛素化酶活性相关,如usp4和usp7的ubl(ubiquitin-like)区域,usp13的第717–781位氨基酸区域等。那么,在usp12的蛋白结构中,除了之前第二部分研究的点突变,在其三个保守结构域外,是否也存在能够调控其去泛素化活性的结构域有待研究。因此,本部分拟将同源性高,但是酶活性差异大的usp12与usp46的氨基酸序列进行比对,并将二者序列差异最多的区域进行互换,构建usp12多位点突变体。然后对此突变体的去泛素化酶活性进行分析,旨在探寻其它能够调控usp12酶活性的蛋白结构区域,从而进一步为宫颈癌的治疗提供分子生物学依据。方法:1pgex-usp12(152-169)及pgex-usp46(148-165)多位点突变质粒的构建:以pgex-usp12(wt)质粒为模板,设计多位点突变的特异引物,进行pcr扩增,通过多个碱基的突变使usp12的152-169位氨基酸由rlpngnidnennnstpdp变为klkngnmnepaennkpel(与usp46的148-165位氨基酸序列一致)。同样的,以pgex-usp46(wt)质粒为模板,设计多位点突变的特异引物,利用多位点突变的方法使usp46的148-165位氨基酸由klkngnmnepaennkpel变为rlpngnidnennnstpdp(与usp12的152-169位氨基酸序列一致)。结论:以上多位点突变后,均进行测序鉴定。2对USP12/USP46多位点突变体去泛素化酶活性的分析:采用UbMet-β-gal模型底物检测系统检测并分析USP12(152-169)以及USP46(148-165)突变体的去泛素化酶活性。结果:1 pGEX-USP12(152-169)及pGEX-USP46(148-165)多位点突变质粒构建成功:测序结果证实,USP12多位点突变型质粒在其预期位点均成功发生定点突变,使得其翻译后的第152-169位氨基酸由RLPNGNIDNENNNSTPDP变为KLKNGNMNEPAENNKPEL,质粒构建成功。另外,USP46多位点突变型质粒也在其预期位点均成功发生定点突变,第148-165位氨基酸由KLKNGNMNEPAENNKPEL变为RLPNGNIDNENNNSTPDP,质粒构建成功。2 USP12的152-169位氨基酸多位点突变对其去泛素化酶活性的影响:模型底物Ub-Met-β-gal检测体系分析结果显示,USP12(152-169)突变体具有去泛素化酶活性。而且,与USP12野生型相比,其去泛素化酶活性显著增强,提高至野生型的331%±28.9%(***P<0.001),基本与USP46野生型的酶活性水平一致。USP46(148-165)突变体与USP46(WT)相比没有变化。结论:1本部分研究利用多位点突变的方法,成功构建了pGEX-USP12(152-169)和pGEX-USP46(148-165)突变型质粒。2底物Ub-Met-β-gal酶活性检测体系中USP12的第152-169位氨基酸发生多位点突变后,其去泛素化酶活性显著增强,并且与USP46野生型活性一致,提示USP12的第152-169位氨基酸区域对调控其去泛素化酶活性具有重要意义。