研究背景：心肌肥厚以心肌细胞蛋白合成增加和细胞体积增大为主要特征,是心脏功能从代偿期向失代偿期演变,心脏结构从可逆性改变向不可逆性改变发展的关键阶段,是心力衰竭的重要病理生理基础。虽然一定程度的心肌肥厚可以减轻室壁压力,帮助心肌代偿性适应增加的压力负荷,但是细胞内持续的促肥厚信号刺激是导致心衰进展的主要不利因素。迄今为止,已经发现多种信号通路参与心肌肥大的发生。其中,钙调控的信号通路在病理性的肥大的发展中,伴有十分重要的作用,因此,调控心肌的钙信号可以治疗心肌肥厚。心肌的钙稳态是钙蛋白相互调控作用的结果。在收缩期,心肌细胞膜去极化时,L型钙通道激活,胞外的少量的钙经由钙通道进入胞内,触发肌质网(SR)释放更多的钙,使胞浆钙浓度升高,引起心肌的收缩。在舒张期,胞浆高浓度的钙能迅速的回收到肌质网,主要是通过肌细胞膜上的钙泵,钠/钙交换体,以及肌质网钙泵实现。钙通道阻滞剂能够抑制L-型钙通道活性,临床上已经证明,在多中动物模型中均可以治疗心肌肥大,然而,由于心肌收缩对钙的依赖性,钙拮抗剂具有抑制心肌收缩力、降低心脏功能的作用,而且,阻滞非心肌钙通道能引起多种副作用,如低血压,便秘,水肿等,因此,研发摒除上述缺点的有效抗心肌肥大的新药一直是该领域研究的热点。虎杖苷(Polydatin, PD)是从中药虎杖中提取出的单体,分子结构为3,4’,5三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷,又名白藜芦醇苷。2010年,Gao JP et al首次报道了,虎杖苷能够通过抑制神经激素而减少心肌肥大和心肌重构,那么,在体实验虎杖苷是否具有直接的对抗心肌肥大作用或者是否能够延缓心衰的进程,我们不得而知。最近的研究表明,虎杖苷能调控钙稳态和心肌收缩,在急性刺激的成年大鼠心肌细胞上,虎杖苷能显著性的降低收缩期的钙瞬变,令人有趣的,虎杖苷能轻微的增加心肌的收缩力而不是降低,因此我们提出假设,虎杖苷能够抑制肥大刺激所引起的钙信号的上调而具有抗心肌肥大的作用,同时并不影响心肌收缩力。已有文献报道,虎杖苷没有改变正常动物的血压和体循环血流动力学,如果假设是正确的,那么有理由猜测虎杖苷是非常理想的治疗心肌肥大的药物。因此,本研究以苯氧肾上腺素所诱导的乳鼠心肌细胞肥大和主动脉缩窄所诱导的成年小鼠肥大为模型,研究虎杖苷治疗心肌肥大的效果,更进一步探讨,虎杖苷是否是通过钙稳态和心肌收缩,钙调蛋白所调控的钙调神经磷酸酶(Calcineurin)-T细胞核因子(NFAT)信号通路起作用的,这个信号通路已经被证实在多种病理性心脏肥大中具有十分重要的作用。本文集中研究,不管是在体还是离体,虎杖苷是通过抑制钙信号和钙调神经磷酸酶-T细胞核因子来降低心肌肥大的发生。目的：本文以苯氧肾上腺素所诱导的乳鼠心肌细胞肥大和压力负荷所诱导的成年小鼠肥大为出发点,首先探讨虎杖苷能否介导抑制苯氧肾上腺素心肌肥大和主动脉缩窄诱导的心肌重构；其次,研究虎杖苷对钙信号和心肌收缩的影响；最后,从细胞信号转导的角度讨论虎杖苷是否通过作用于Calcineurin/NFAT信号通路抑制心肌肥大。方法：1实验方法1.1实验分组设计离体实验,分别设立对照组(Con),虎杖苷单独作用组(PD),苯氧肾上腺素组(PE),苯氧肾上腺组+虎杖苷(PE+PD),白藜芦醇单独作用组(RV),苯氧肾上腺组+白藜芦醇(PE+RV),苯氧肾上腺组+硝苯地平(PE+Nife),苯氧肾上腺组+虎杖苷+硝苯地平(PE+PD+Nife),苯氧肾上腺素组+他克司莫(PE+FK506),苯氧肾上腺组+虎杖苷+他克司莫(PE+PD+FK506),检测不同的基因蛋白表达。在体实验,分别设立假手术组(Sham),主动脉缩窄手术(TAC),虎杖苷单独作用组(PD),主动脉缩窄+虎杖苷(TAC+PD)。1.2心肌肥大基因的表达以及心脏功能的测定离体部分,分离乳鼠心肌细胞,饥饿24h, PE (20μmol/L), PD(乙醇溶解,50μmol/l)刺激72h。Western blot检测各组ANP和β-MHC的表达,以及心肌细胞面积。在体部分,采用小动物超声对小鼠不同时间点的心脏结构和功能进行评估,其中PD组(β-环糊精溶解,PD用量50mg/kg/day),术后一周开始灌胃,直到13周结束,TAC+PD(β-环糊精溶解),术后一周开始灌胃直到13周结束。1.3心肌肥大钙信号的测定应用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜系统检测PD对乳鼠心肌细胞以及成年小鼠心肌细胞钙信号的影响,包括各组收缩,钙瞬变(AF/Fo), T50(钙瞬变半衰期),rise time(钙瞬变达到峰值的上升时间)。1.4心肌肥大Calcineurin-NFAT3信号通路活性与蛋白的测定应用试剂盒检测Calcineurin活性,Western Blot检测Calcineurin蛋白表达以及NFAT3核转移情况。结果：第一部分：虎杖苷抗心肌肥厚作用(一)离体实验PD抗心肌肥厚作用1、PD减少ANP和β-MHC蛋白表达我们首先观察了,不同处理组对细胞ANP和β-MHC蛋白水平的影响,结果显示,各组之间的ANP和β-MHC蛋白水平均有显著性差异(F值分别为6.259、13.728；P值分别为0.017、0.002)。与Control组相比,PE组心肌细胞ANP (ANP/β-actin:1.00±0.00 vs.1.96±0.42, P=0.017)和β-MHC (β-MHC/β-actin: 1.00±0.00 vs.2.22±0.35, P= 0.002)的表达水平显著上调,而PE+PD组可以部分抑制上述两种基因的表达水平(P<0.05-0.001)。细胞面积测定结果显示：与PE(1914.62±530.47)组相比,PE+PD组心肌细胞面积(1475.80±483.27)显著降低。2、PD和RV抗心肌肥厚作用比较不同处理组对细胞β-MHC的mRNA水平,ANP和β-MHC蛋白水平的影响,结果显示,各组之间的β-MHC的RNA水平ANP和β-MHC蛋白水平均有显著性差异(F值分别为6.206、4.126、9.319；P值分别为0.005、0.021、0.001)。与对照组相比,β-MHC的RNA水平增加到1.99±0.35(P<0.01)。PD(50μM)和RV (25μM)单独处理组对β-MHC的RNA水平无显著趋势。而PE+RV降低为1.42±0.26(vs PE, P<0.05), PE+PD组降低为1.43±0.35(vs PE, P<0.05)。而PE+RV组和PE+PD组两组间无差异(P>0.05)。其次,与对照组相比,ANP的蛋白水平增加到1.99±0.34 (P<0.01), PD (50μM)和RV(25μM)单独处理组对ANP的蛋白水平无显著趋势。而PE+RV降低为1.36±0.23(vs PE,P<0.05), PE+PD组降低为1.24±0.39(vs PE, P<0.05)。而PE+RV组和PE+PD组两组间无差异(P>0.05)。与对照组相比,PE组β-MHC蛋白水平增加到2.22±0.35 (P<0.01), PD (50μM)和RV (25μM)单独处理组对β-MHC的蛋白水平无显著趋势。而PE+RV降低了1.70±0.39(vs PE, P<0.05), PE+PD组降低到1.68±0.30(vsPE,P<0.05)。而PE+RV组和PE+PD组两组间无差异(P>0.05)。但PE+RV组与对照组比较,P<0.05, PE+PD与对照组比较,P<0.05,都具有显著差异。(二)在体实验PD抗心肌肥厚作用1、PD抑制心肌重构我们观察了5w、13w小鼠的LVPWs和LVPWd,结果显示,在5w、13w时,各组间的LVPWs数值具有显著差异(F值分别为20.797、15.915；P值分别为0.000、0.000)。各组间的LVPWd数值具有显著差异(F值分别为11.234、11.359；P值分别为0.000、0.001)。与同时期的Sham组相比较,TAC组的LVPWs和LVPWd显著增加,而PD处理能够显著的抑制增高的后壁厚度。同样的,与Sham组比较,在5w时,TAC组的LVIDs和LVIDd显著减小,13w时显著增大,而PD处理后,与TAC比较,TAC+PD组,5w时能显著的抑制心腔的缩小,13时能显著的抑制心腔的扩大。2、PD改善心功能我们观察了不同时间点各组的LVFS和EF。结果显示,5w、13w时,LVFS各组间有显著性差异(F值分别为7.948、12.597；P值分别为0.000、0.000)。EF各组间有显著性差异(F值分别为6.180、11.228；P值分别为0.008、0.001)。与Sham (30.69±3.93)相比,TAC组5w时,LVFS增高为44.11±6.09,P<0.01,与Sham组(52.94±4.23)比较,EF增高为71.99±5.78,P<0.01,有显著差异。在13w时,二者显著低于Sham,其中,LVFS降低为21.36±4.48 (vs sham 32.94±1.69),P<0.01,有显著差异。EF降低到38.00±7.12 (vs sham,54.25±2.48),P<0.01,有显著差异。PD处理后,与Sham比较,5w时,TAC+PD组,LVFS和EF平稳的增加,P>0.01,无统计学意义。而13w时,PD处理后,TAC+PD组远没到失代偿阶段,与TAC比较,TAC+PD组的LVFS增高到34.45±4.11,P<0.01,具有统计学差异,而EF增高到56.93±5.27,P<0.01,差异显著。而PD单独处理组,与Sham比较,无显著差异。3、PD抑制心肌肥厚小鼠HW/BW我们在13w,观察了不同处理组对小鼠的HW/BW的影响,结果显示不同处理组间具有显著性差异(F值为0.000；P值为21.143)。相比于Sham(0.504%±0.01%)组,TAC组的HW/BW也是显著增高到0.627%±0.04%,P<0.01而PD治疗后,与TAC组比较,TAC+PD组心重体重比下降到0.549%±0.03%,P<0.01,但TAC+PD组与Sham组比较,升高了8.9%,P值小于0.01。4、PD抑制心肌肥厚小鼠ANP和β-MHC表达在13w提取各组的组织蛋白,检测观察了不同处理组对小鼠的ANP和β-MHC蛋白表达水平,结果显示不同处理组ANP和β-MHC蛋白表达水平具有显著差异(F值分别为9.396、62.264；P值分别为0.013、0.000)。相比于Sham(1.00±0.00)组,TAC组小鼠心肌ANP和β-MHC的表达水平显著上调,ANP升高到2.32±0.55, P<0.01, p-MHC增高到2.92±0.29,P<0.01,而TAC+PD组可以部分抑制上述2种基因的表达水平。与TAC组比较,TAC+PD组的ANP降低为1.48±0.50 (vs TAC,2.32±0.55), P<0.05, β-MHC降低为1.89±0.30(vs TAC,2.92±0.29), P<0.01,其中,与Sham组比较,TAC+PD组的P-MHC显著增加,P<0.05。第二部分：虎杖苷对心肌钙信号的作用1、PD对乳鼠心肌钙信号的影响在培养的NRVMs上,我们检测了各种处理对钙信号的影响,包括△F/Fo, rise time, Tso,结果显示,各组间均有统计学差异。其中△F/Fo, rise time, T50分别为13.18、6.898、12.453；P值分别为0.000、0.000、0.000)。与Con(4.52±1.18)比较,PE刺激能使AF/Fo增高到6.32±2.12 (vs con,4.52±1.18), P<0.01, SR回收Ca2+的时间(钙瞬变半衰期,T50)、显著延长为170.13±48.42 (vs con,137.63±20.52),P<0.01。此外持续性的PE刺激,导致钙瞬变的上升时间(rise time)显著增加到74.29±27.9 (vs con,53.13±18.49), P<0.01, PD单独处理组使正常细胞钙瞬变有下降的趋势,P>0.05,无统计学意义。但是,与PE组相比,PE+PD (4.86±1.47)组能显著降低PE所诱导增加的钙瞬变(vs PE, P<0.01),与PE组相比,PE+PD组的rise time和T50的分别降低为143.54±17.83,P<0.05,和57.344±18.07,P<0.05,差异均具有统计学意义。2、PD对成年小鼠心肌钙信号的影响在5w时,我们分离个成年小鼠单个细胞,检测PD对钙信号的影响,包括△F/F0,Shortening, T50,方差分析结果表明,各组间分别具有差异(F值分别为6.017、10.817、10.985；P值分别为0.000、0.000、0.000)。与Sham组(1.80±0.60)比较,TAC组钙瞬变(△F/F0)增加到2.47±0.96,P<0.01,而T50延长为196.33±35.18 (vs sham,172.00±15.19), P<0.01,与TAC相比,TAC+PD组能显著降低到1.83±0.83,P<0.01,并且T50降低到165.00±34.89,P<0.01。与Sham组(4.69±1.53)比较,TAC组在5w时,心肌收缩力增加到6.56±3.13,P<0.01,与Sham比较,TAC+PD组分离出的单个心肌细胞的钙瞬变无显著变化,P>0.05,但收缩力却显著增高到6.49±2.69(P<0.01)。第三部分：PD抑制Calcineurin/NFAT3促肥厚信号通路1、PD离体抑制Calcineurin/NFAT3信号通路在培养的NRVMs上,我们观测了PD对Calcineurin/NFAT信号通路的影响,结果显示,Calcineurin蛋白无显著差异(F值为3.108；P值为0.089), Calcineurin的活性,各组间的F值分别为8.252；P值分别为0.008。与正常组(1.00±0.00)比较,PE显著增高Calcineurin活性增加到2.03±0.40,P<0.01,差异显著。但Calcineurin蛋白有上升的趋势,无统计差异。紧接着,PE组NFAT3转移入核,PE组的核蛋白NFAT3显著增加了1倍,P<0.05,而PE组胞浆的NFAT3是降低了,P<0.05,PD单独处理组对细胞的Calcineurin的活性,NFAT3蛋白无显著变化。但是PD处理却能显著降低PE所致的上升的Calcineurin活性。结果显示与PE组比较,PE+PD组的Calcineurin活性降低为1.30±0.10(vs PE),P<0.05,差异具有统计学意义。核蛋白NFAT3减少了62.5%,P<0.05,胞浆蛋白NFAT3显著升高了,P>0.05。2、PD在体抑制Calcineurin/NFAT信号通路TAC小鼠5w时,提取组织蛋白,我们在组织上观测了PD对Calcineurin/NFAT信号通路的影响,结果显示Calcineurin蛋白,Calcineurin活性,各组间的F值分别为12.398、5.889、3.613、4.482；P值分别为0.003、0.038。与Sham组比较,TAC组的Calcineurin蛋白增加了1.43倍,Calcineurin活性增加了将近一倍,P值均小于0.01。核蛋白NFAT3显著上升,而胞浆NFAT3显著下降。同时,相比于TAC组,TAC+PD组的Calcineurin蛋白的活性下降到1.32±0.20(P<0.05)和Calcineurin蛋白表达显著降低为1.65±0.30(P<0.05),同时,与TAC组比较,TAC+PD组的核蛋白NFAT3显著降低,胞浆NFAT3显著增加。结论：1.PD可增强心肌细胞的抗肥厚能力。2.PD具有抗抑制心脏重构、改善心功能的作用,延缓从心肌肥厚过度到心力衰竭的病理生理进程。3.PD能修复肥大所引起的异常的钙信号,且不降低心肌收缩力。4.PD抑制Calcineurin/NFAT促肥厚信号通路。