心血管并发症是致2型糖尿病患者死亡的主要原因,而内皮功能障碍是导致心血管病变的始动因素和早期表现。一氧化氮(nitric oxide, NO)是维护内皮细胞生理功能的重要因子。NO产生减少或生物活性下降是导致糖尿病内皮功能障碍的主要原因。据此防治糖尿病心血管病变的基本策略是降血糖同时改善血管内皮功能障碍,而改善血管内皮功能障碍的关键是平衡NO系统功能。黄连素(berberine, BER)即小檗碱是黄连抗糖尿病的主要成分。近年,越来越多的临床及动物实验证实黄连素可以治疗糖尿病和心血管疾病,具有确切的降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗、抗过氧化、抗高血压等作用,机制可能与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有关。然而黄连素是否可以改善糖尿病内皮功能障碍,国内外尚未见报道。本研究采用高脂饮食联合小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠模型及高游离脂肪酸(软脂酸)培养HUVEC模拟内皮损伤细胞模型,从功能、形态、细胞及分子水平探讨黄连素对糖尿病内皮细胞功能损伤的保护作用,并揭示其分子机制,为将黄连素作为治疗糖尿病及其心血管并发症的新药提供理论基础及实验依据。研究内容如下:1.黄连素对2型糖尿病大鼠血管内皮功能障碍的保护作用:检测血清生化学指标及采用IPGTT实验观察黄连素降糖、降脂及对胰岛素抵抗的影响;检测血清中NO水平和SOD活性;采用离体血管功能实验观察黄连素对糖尿病大鼠胸主动脉舒张及收缩功能的影响;采用RT-PCR法检测大鼠胸主动脉组织内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达,免疫组织化学法检测eNOS蛋白表达,Western blot检测eNOS及NADPH氧化酶(NOX4)蛋白表达;HE染色观察主动脉病理形态学改变。结果显示,黄连素明显降低糖尿病大鼠的血糖、血脂,提高胰岛素敏感指数,改善了胰岛素抵抗;黄连素提高血清中SOD活性,增加机体的抗氧化能力;黄连素显著改善糖尿病引起的NO介导的内皮依赖性血管舒张功能损伤,并显著增加糖尿病大鼠胸主动脉组织中eNOS mRNA及蛋白表达,减少NOX4蛋白表达,同时增加血清中NO水平;黄连素可以明显减轻糖尿病大鼠胸主动脉的内皮损伤。这些结果说明黄连素不仅对2型糖尿病大鼠具有显著的治疗作用,同时对糖尿病诱导的内皮功能障碍具有良好的保护作用,机制可能与上调eNOS基因和蛋白表达,增加NO产生,下调NOX4表达,减少ROS产生,减少NO灭活,平衡NO系统功能有关。2.为进一步探讨黄连素保护糖尿病内皮功能障碍的分子机制,采用软脂酸(palmitate)培养HUVECs建立高游离脂肪酸(FFA)损伤内皮细胞模型,观察黄连素对软脂酸培养HUVECs存活率及细胞形态的影响;检测细胞培养上清液中NO水平;DCHF-DA荧光探针检测细胞内ROS产生;RT-PCR法检测HUVECs eNOS mRNA表达;Western blot检测eNOS,p-eNOS,Akt,p-Akt,AMPK,p-AMPK及NOX4蛋白表达。结果显示,黄连素能轻度提高软脂酸培养HUVECs的存活率,恢复细胞形态,提高细胞培养上清液中NO水平,降低HUVECs内ROS产生,减轻高FFA对HUVECs的损伤。黄连素可以上调软脂酸培养HUVECs eNOS mRNA,蛋白和磷酸化蛋白表达,上调AMPK及磷酸化AMPK蛋白表达,而对Akt及磷酸化Akt蛋白表达无明显影响,同时明显下调NOX4蛋白表达,这些结果说明黄连素可以调节eNOS及NOX4表达及活性,平衡NO系统功能,保护HUVECs免受高FFA损伤,其机制可能与激活AMPK有关。