背景和目的：　　慢性下腰痛是目前最常见的疾病之一，并成为致残的重要原因。它已造成极大的社会经济负担。慢性下腰痛的主要原因是椎间盘退变。作为最大的无血管器官，髓核和内层纤维环所需的氧气和营养物质是通过软骨终板(CEP)的扩散提供的。软骨终板是位于椎间盘上下缘薄薄一层厚度小于1毫米软骨，在脊柱局部的生物力学和生化功能中扮演非常重要的角色。软骨终板的退行性变可导致低养分供应、低氧张力、乳酸堆积，从而诱导椎间盘变性。因此，软骨终板退变与椎间盘变性和下腰痛息息相关。　　椎体终板及软骨下骨在磁共振成像(MRI)上信号强度的变化是脊柱退行性疾病中的一种常见现象。1988年，Modic总结了这些变化，称他们为Modic改变(Modicchanges，MCs)，并分为三种类型。Ⅰ型，在T1加权像上显示为低信号，T2加权像上相对正常终板显示为高信号，组织病理学表现为组织水肿和血管化增加;Ⅱ型，在T1加权像上为高信号，T2加权像上表现为等信号或轻度高信号，组织病理学表现为红骨髓被黄骨髓取代;Ⅲ型，在T1加权像及T2加权像上均表现为低信号，组织病理学表现为骨质硬化。尽管Modic改变的原因和病理生理学尚不清楚，但是多数学者认为炎症介质可能在软骨终板退化中起着重要的作用。Crock认为髓核中的炎症因子弥漫可能导致软骨终板的炎症反应，从而继发退变。在两个临床研究中发现，化学髓核溶解术后邻近终板发生了Modic改变。Ohtori等发现，肿瘤坏死因子(TNF)阳性的免疫反应性细胞在伴有Modic改变的软骨终板明显比MRI正常的软骨终板多。然而，到目前为止，关于软骨终板变性的炎症机制的研究还很少。　　基于上述的观察，我们假设IL-1β参与软骨终板退变中ADAMTS-5的表达，且通过NF-κB途径上调终板软骨细胞的ADAMTS-5表达。通过以下实验来验证这个假设:分析伴Modic改变的人腰椎软骨终板中ADAMTS-5的表达水平及其与IL-1β表达的相关性;通过牛终板软骨细胞的体外实验，研究IL-1β对终板软骨细胞的ADAMTS-5表达的刺激作用，及其调控机制。　　方法：　　1. 使用geNorm、 NormFinder和BestKeeper三种软件筛选出在Modic改变(MCs)腰椎软骨终板细胞中表达最为稳定的管家基因作为内参，对qRT-PCR进行标准化。　　所有腰椎软骨标本选自各种腰椎疾患而行椎体间融合术的患者。软骨终板有MCs的患者纳入到MCs组，没有MCs的归为对照组。MCs组和对照组分别有来自12个患者的样本。两组间患者的的年龄、性别相匹配，无统计学差异。从既往文献中常用的管家基因及关于骨性关节炎软骨的基因芯片表达数据中选取12个备选基因。终板软骨的RNA提取依照Untergasser所述方法进行操作。逆转录采用ReverseTRanscription System试剂金Reverse Transcription System。 qRT-PCR采用GoTaqqRCP Master Mix试剂盒操作完成。每个样本Ct值的数据分析采用3个基于微软Excel平台的宏程序:即geNorm，NormFinder和BestKeeper。这些统计算法被用来评估12个候选内参基因的稳定性，并确定Modic改变腰椎软骨终板细胞中最适合作内参的管家基因，对qRT-PCR进行标准化。　　2. 确定腰椎软骨终板退变中ADAMTS-5表达的变化及其与IL-1β的相关性　　所有腰椎退行性软骨终板标本选自因伴Modic改变的下腰痛疾患而行椎体间融合术的患者，纳入到MCs组。没有下腰痛病史而因胸腰椎爆裂性骨折需病椎和相邻椎间盘切除并植骨重建的患者纳入到对照组。组织学分析伴Modic改变的软骨终板(CEP)中细胞外基质蛋白表达的变化。RNA提取和qRT-PCR技术分析软骨组织退变相关的细胞外基质、ADAMTS和IL-1β的mRNA在MCs组和对照组两者间的表达差异。免疫组织化学方法研究两组CEP中ADAMTS-4，ADAMTS-5和IL-1β各自的免疫反应阳性的细胞百分数。用Spearman相关系数(Spearmanρ test)方法，从mRNA表达及免疫反应阳性细胞的百分率两个方面，分析腰椎软骨终板退变中ADAMTS-5表达与IL-1β之间的相关性。　　3. 通过牛终板软骨细胞的体外实验，明确IL-1β能促进终板软骨细胞ADAMTS-5表达，并通过NF-κB信号通路来调控ADAMTS-5的表达　　用qRT-PCR技术，免疫细胞化学方法，Western Blot等多种分子生物技术，检测IL-1β对牛终板软骨细胞中ADAMTS-5表达的刺激效应。应用Western Blot分析IL-1β对牛终板软骨细胞的NF-κB信号通路的激活作用。并通过应用NF-κB抑制剂SN50阻断IL-1β对牛终板软骨细胞ADAMTS-5表达的刺激，反向证实IL-1β通过NF-κB信号通路上调ADAMTS-5的表达。　　结果：　　1. 12个备选内参基因的Ct值范围为从17.6(18S rRNA)到33.5(ACTB)。在GeNorm分析中，M值最小的为SDHA和B2M(0.45)，因此它们是表达水平最稳定的两个基因。按照表达水平稳定性从最高到最低进行排序，具体顺序为SDHA=B2M＞LDHA＞TBP＞GUSB＞GAPDH＞IPO8＞HMBS＞ACTB＞HPRT1＞18SrRNA＞RPL13A。在NormFinder分析中，所有样本中最稳定的基因是LDHA，其M值为0.102，随后依次为SDHA、 B2M、GUSB、GAPDH、IPO8、HMBS、ACTB、TBP、18S rRNA、HPRT1和RPL13A。在BestKeeper分析中，SDHA和ACTB的CV±SD值最小，因此被认为是所有样本中表达最稳定的两个基因。SDHA是所有样本中表达最稳定的单个基因，而SDHA、B2M和LDHA则是最佳的联合内参基因选择。　　2. MCs组表现为软骨细胞外基质(ECM)纤维化、硬化，以及软骨细胞密度显著降低。并可观察到细胞肥大、集群和呈现多种细胞形态。番红O-固绿染色显示MCs组PG含量明显减少。细胞外基质的基因表达水平的qRT-PCR检测中， MC组的Ⅱ型胶原的mRNA表达水平较对照组明显降低（P＜0.05）;MC组中ADAMTS-5mRNA表达与对照组相比显著增加（P＜0.05）。免疫组织化学实验显示，MC组ADAMTS-5免疫检测阳性的细胞百分比明显高于对照组(P＜0.01)。而MC组中ADAMTS-4mRNA表达水平和免疫检测阳性的细胞百分率只较对照组稍微增加而无统计学意义。在mRNA表达及免疫反应阳性细胞的百分率两个方面，Spearman相关系数（Spearmanρ test）分析均证实腰椎软骨终板退变中IL-1β表达增强与ADAMTS-5高水平表达之间呈正相关。　　3. IL-1β能上调牛终板软骨细胞的ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平。经IL-1β(10 ng/mL)作用48小时后，RT-PCR和Western Blot分别显示牛终板软骨细胞ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平均显著增加（P＜0.01）。免疫细胞化学的方法发现IL-1β作用以后，ADAMTS-5蛋白阳性的牛终板软骨细胞数及细胞内ADAMTS-5蛋白的荧光强度较与对照组显著增强。在(10 ng/mL)IL-1β作用15min后，牛终板软骨细胞的p-p65的蛋白浓度明显升高， IκB-α的蛋白浓度明显降低，而p65在始终基本保持不变。IL-1β对牛终板软骨细胞ADAMTS-5表达的刺激作用可以被NF-κB抑制剂SN50(50微克/毫升)有效阻断。　　结论：　　1. 这是第一个为确保腰椎终板软骨细胞中基因表达水平评估的可靠性而选择合适内参基因的研究。我们的研究发现在所有样本中，表达最稳定的基因是SDHA，联合采用SDHA、B2M和LDHA作为内参基因，可以获得更为精准的结果。　　2. 伴Modic改变的腰椎终板软骨细胞中ADAMTS-5mRNA表达水平较正常软骨终板有显著增加，而ADAMTS-4表达水平无明显改变。ADAMTS-5mRNA表达水平与IL-1β表达呈正相关，提示IL-1β可能选择性地上调终板软骨细胞ADAMTS-5的表达。　　3. 我们的研究首次证实，IL-1β可以诱导牛终板软骨细胞中的ADAMTS-5表达，但不作用于ADAMTS-4。从IL-1β对牛终板软骨细胞NF-κB信号通路的有效激活及NF-κB抑制剂SN50对IL-1β刺激的有效阻断两方面证实IL-1β可通过NF-κB信号通路上调终板软骨细胞ADAMTS-5的表达。