研究背景糖尿病溃疡(Diabetes ulcers,DUs)的发生是糖尿病最常见的并发症之一,将近15%的糖尿病患者并发DUs,14%-20%的DUs患者持续进展,迁延不愈,最终导致非创伤性截肢,极大降低患者的生活质量。目前,DUs的标准化治疗,尽管专注于促进愈合,但是往往局限于清创和感染预防,缺乏靶向分子机制的有效治疗方案。因此,寻找安全有效的针对性治疗措施是现今DUs治疗的迫切需求。近来研究表明,类似ECH相关的凯尔奇蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E-2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)通路是体内重要的内源性抗氧化应激防御体系,Keap1/Nrf2通路受损与多种疾病相关。课题组前期研究发现,DUs患者创缘处皮肤氧化应激损伤严重,Nrf2通路代偿性激活;腹腔注射Nrf2的激动剂——莱菔硫烷(Sulforaphane,SF)和肉桂醛(cinnamic aldehyde,CA)促进STZ诱导的糖尿病小鼠创口愈合;并且,另有研究证实,在db/db糖尿病小鼠创口局部使用Keap1si RNA治疗,上调Nrf2的表达,上皮再生能力明显提高,糖尿病创口闭合速度增快。综上可知,局部调节糖尿病创口处的Nrf2通路可能促进创口愈合。鉴于CA特异性激活Nrf2通路,由此,我们提出假设,局部应用CA激活Nrf2通路有助于糖尿病创口愈合。近来研究发现,与CA性状相似的SF可溶于聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)系列200,300,400和600中,安全可靠,药效稳定,可以制成凝胶、软膏或霜等。既往研究证实,PEG是一种无毒的生物惰性物质,无刺激性,具有良好的水溶性、保湿性。因此,我们配制了添加CA的PEG400制成的凝胶,观察局部外用CA对DUs的疗效并进一步探讨其可能机制。研究目的1、观察局部应用CA对糖尿病溃疡愈合的影响;2、探讨CA对糖尿病溃疡的影响是否依赖于Nrf2通路。材料和方法实验材料:8周龄的Nrf2+/+和Nrf2-/-雄性SKH-1无毛小鼠各8只,由美国亚利桑那大学药学院Donna.D.Zhang教授馈赠;链脲霉素(Streptozotocin,STZ)、CA购自Sigma公司(St.Louis,MO)。实验分组:(1)Nrf2+/+鼠对照组(Nrf2+/+Veh组);(2)Nrf2+/+鼠CA治疗组(Nrf2+/+CA组);(3)Nrf2-/-鼠Veh组(Nrf2-/-Veh组);(4)Nrf2-/-鼠CA组(Nrf2-/-CA组),每组4只。实验方法:1、实时监测创口愈合速率评估局部应用CA对Nrf2+/+和Nrf2-/-糖尿病小鼠创口愈合的影响;2、HE染色分析各组创缘处皮肤组织学差异;3、免疫组化染色分析局部应用CA对创缘处皮肤Nrf2、下游靶蛋白HO-1及氧化损伤相关指标8-oxo-d G表达水平的影响;研究结果1、局部应用CA显著促进Nrf2+/+小鼠糖尿病创口愈合实时观察Nrf2+/+小鼠创口愈合过程中各个时间点的改变,与Nrf2+/+Veh组相比,Nrf2+/+CA组从创口愈合的第9天,创口愈合速率显著增加(P<0.05);并且局部应用CA后创口愈合第14天新生上皮已完全形成,组织学完整,而Nrf2+/+Veh组创面处仍有疏松肉芽组织和未脱落的痂,新生上皮并未完全覆盖创面,表明局部应用CA显著改善Nrf2+/+糖尿病小鼠创口愈合。2、局部应用CA并不影响促进Nrf2-/-小鼠糖尿病创口愈合进一步观察了CA对Nrf2-/-糖尿病小鼠创口愈合的影响。结果表明Nrf2-/-CA组和Nrf2-/-Veh组小鼠创口愈合速率并无差异;在创口愈合的第14天,创口处组织学并无新生上皮覆盖,而是新鲜的肉芽组织。上述结果表明局部应用CA对Nrf2-/-小鼠糖尿病创口愈合并无显著作用。3、局部应用CA激活糖尿病小鼠创口皮肤Nrf2通路,缓解氧化应激损伤对比Nrf2+/+Veh组和Nrf2+/+CA组,局部应用CA显著增强创缘处皮肤Nrf2及下游靶蛋白HO-1的表达,并且降低创缘皮肤8-oxo-d G的水平。提示在Nrf2+/+糖尿病鼠创口愈合过程中,局部应用CA激活了创缘处皮肤的Nrf2通路,缓解皮肤的氧化应激损伤。4、局部应用CA并不影响Nrf2-/-糖尿病小鼠创缘处皮肤的氧化应激损伤在Nrf2-/-Veh组和Nrf2-/-CA组中,Nrf2蛋白并无表达,局部应用CA并不改变Nrf2-/-小鼠创缘皮肤HO-1及8-oxo-d G的表达水平。提示在Nrf2-/-糖尿病小鼠创口愈合过程中,局部应用CA对Nrf2通路及氧化应激损伤并无影响。结论综上,本研究证实了CA局部应用促进糖尿病小鼠创口愈合,缓解创缘皮肤的氧化应激损伤依赖于Nrf2通路的激活;CA与PEG400配制的水凝胶局部应用疗效稳定可靠,效果显著,排除了全身应用CA的其他潜在影响,为CA应用于临床DUs的治疗提供了实验依据和新的治疗途径。研究背景临床上治疗糖尿病的药物多种多样,一些抗糖尿病的药物具有降糖作用之外的额外效应,并且糖尿病患者往往伴随多种并发症及合并症,鉴于上述复杂现状,如何选择最佳的个体化降糖治疗方案并不完全清楚。近来临床试验表明,利拉鲁肽可以使患者心血管系统获益,达格列净具有降低血压的效应,二甲双胍可以减少超重孕妇的体重而不影响新生儿的体重等。另一方面,一些降糖药物还有一些不良的额外效应,如沙格列汀增加心衰患者的住院风险,达格列净增加肾衰的发生率。上述结果表明更好的了解降糖药物的额外效应对优化临床降糖药物的选择有重要意义。二肽基肽酶-4抑制剂(Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors,DPP-4i)是世界范围内广泛使用的经典降糖药物之一,由于其有效的血糖控制和较小的低血糖风险而被美国临床内分泌协会推荐为2型糖尿病患者的一线降糖药物。一般而言,DPP-4i通过延长葡萄糖依赖促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)和内源性胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)的半衰期从而降低糖尿病患者的糖化血红蛋白水平。然而,除了降糖作用,一些研究提示DPP-4i对肾、心血管系统等可能还有一些额外效应。考虑到DPP-4i的多效性,在服用DPP-4i期间是否还会有其它一些额外作用尚需进一步的调查。近来研究表明,DPP-4i被证实可以激活核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor,Nrf2)通路,而Nrf2通路与糖尿病溃疡(diabetic ulcers,DUs)愈合相关,提示DPP-4i可能影响糖尿病创口愈合。研究目的1、观察DPP-4i对糖尿病创口愈合的影响;2、探讨DPP-4i影响创口愈合的可能机制;研究方法1、观察DPP4i对糖尿病创口愈合的影响首先,体外培养的人皮肤角质细胞(Ha Ca T)建立体外创口愈合模型,观察临床常用的5种DPP-4i(沙格列汀、西格列汀、阿格列汀、维格列汀、利格列汀)对创口愈合的影响;其次,采用STZ诱导糖尿病小鼠模型,待糖尿病模型成立后,开始实施DPP-4i(沙格列汀)灌胃治疗,1周后手术建立直径为6mm的全层皮肤切除创口,实时监测创口愈合速率,绘制创口闭合速率曲线,比较沙格列汀对创口愈合的影响。此外,HE染色分析创口愈合第14天的组织学差异。2、观察DPP-4i对创口愈合的影响是否依赖于NRF2通路;首先在体外培养的Ha Ca T细胞中,采用NRF2si RNA转染技术干扰角质细胞中的NRF2通路,对比阻断NRF2通路和未阻断NRF2通路的情况下,沙格列汀对创口愈合的作用是否有差异;其次,建立Nrf2-/-糖尿病小鼠创口模型,观察DPP-4i(沙格列汀)对Nrf2-/-糖尿病小鼠创口愈合的作用。3、DPP-4i在创口愈合中对不同细胞功能的影响通过迁移实验——去聚二甲基硅氧烷膜(polydimethylsiloxan,PDMS)划痕实验或Transwell实验)、CCK-8增殖实验,免疫印迹分析DPP-4i干预后Ha Ca T和人包皮成纤维细胞(HFF)增殖、迁移等功能的变化。4、DPP-4i对糖尿病创口处皮肤功能的影响采用免疫荧光和免疫组化比较DPP-4i对糖尿病小鼠和DUs患者创口愈合过程中上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)过程和SDF-1α表达水平的影响;5、q RT-PCR和马森染色分析糖尿病小鼠创缘皮肤胶原(COL1A1、COL3A1、FN1)表达水平的改变和沉积差异。6、DPP-4i对糖尿病患者创口愈合的疗效观察纳入67例DUs患者进行临床随机对照研究(NCT02742233),通过比较溃疡愈合时间、13周溃疡愈合人数百分率等评估沙格列汀对DUs的临床疗效。研究结果1、体外创口愈合实验和体内动物实验证实DPP-4i显著促进糖尿病创口愈合;1.1成功建立体外创口愈合模型,发现DPP-4i(沙格列汀、西格列汀、阿格列汀、维格列汀、利格列汀)干预后,创口面积显著减少,表明DPP-4i显著促进创口愈合。1.2成功建立STZ诱导的糖尿病小鼠创口模型,DDP-4i(沙格列汀)治疗后,创口愈合速率增快明显;并且,组织学染色分析发现在创口愈合的第14天,沙格列汀治疗后新生上皮再生加快,完全覆盖创口。2、DPP-4i促进糖尿病创口愈合并不主要通过Nrf2通路;2.1采用NRF2si RNA干扰Ha Ca T细胞的NRF2通路后建立体外创口愈合模型,提示在阻断NRF2通路的情况下,经沙格列汀干预后仍显著促进创口愈合,表明沙格列汀促进创口愈合并不主要通过NRF2通路。2.2成功建立Nrf2-/-糖尿病小鼠创口模型,发现不同时间点沙格列汀干预后均能显著促进糖尿病创口愈合,证实敲除Nrf2通路,沙格列汀仍能显著促进糖尿病创口愈合。3、DPP-4i诱导角质细胞发生EMT,并且促进角质细胞迁移3.1体外实验发现,DPP-4i既不影响Ha Ca T细胞和HFF细胞增殖,也不影响HFF细胞迁移,但能显著促进Ha Ca T细胞迁移。3.2形态学观察发现DPP-4i诱导Ha Ca T细胞发生类似于EMT的间质态转变,进一步检测EMT相关的蛋白水平发现,DPP-4i干预后下调上皮相关蛋白E-cadherin的表达水平,并且上调间质相关蛋白Vimentin,SNAIL1的表达水平,表明DPP-4i可以诱导角质细胞发生EMT。4、DPP-4i通过促进成纤维细胞表达SDF-1α间接诱导角质细胞发生EMT;4.1进一步探讨DPP-4i对HFF细胞分泌功能的影响,发现DPP-4i并不影响HFF细胞的VEGF、TGF-β1、Cox-2、HMGB1的表达水平,但是显著增强SDF-1α的表达。4.2体外进一步研究发现,SDF-1α干预Ha Ca T细胞后,显著诱导Ha Ca T细胞发生EMT,表明DPP-4i通过增强成纤维细胞表达SDF-1α间接诱导角质细胞发生EMT。5、DPP-4i增强糖尿病鼠创口处SDF-1α的表达,诱导EMT,并且减少瘢痕形成5.1成功建立STZ诱导的糖尿病小鼠创口模型,在沙格列汀干预后创口愈合的不同时间点收集创缘皮肤进一步检测。5.2免疫荧光染色分析发现,沙格列汀干预后在创口愈合前期,可以显著诱导创缘皮肤发生EMT,并且增强创缘处皮肤SDF-1α的表达水平。5.3进一步检测发现,在糖尿病小鼠创口愈合后期,沙格列汀治疗后显著减少了胶原COL1A1、COL3A1和FN1的表达,并且缓解了创口处的胶原堆积水平,表明DPP-4i干预后可以改善瘢痕形成。6、DPP-4i改善糖尿病患者的创口愈合临床随机对照研究进一步证实上述结果,在两组参与者基准线相近的情况下,服用沙格列汀与安慰剂组对比,13周后两组患者血糖水平并无显著差异,但是沙格列汀组的DUs患者较安慰剂组创口愈合的中位愈合时间缩短了15天(P<0.05);治疗13周后创口愈合人数百分率比安慰剂组高36.08%((P<0.05)。Kaplan-Meir生存分析评估创口愈合事件(Log rank=15.08,P=0.0001),进一步证实沙格列汀显著促进DUs愈合,并且独立于其血糖控制的作用。结论本研究揭示了DPP4i通过直接和间接途径诱导上皮细胞发生EMT,并且减少瘢痕形成从而改善糖尿病创口愈合,为糖尿病合并溃疡患者优先选用DPP4i奠定了临床和实验依据。