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植物地理学研究的重点是植物的起源、演化与空间分布的关系,主要依托于植物在某一地理区域内表现出的规律性。这种规律可以是外在形态,也可以是内在特异基因。本研究以药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F)为具体研究对象,通过对不同种源及个体的遗传多样性和遗传结构的研究,探讨地理差异和人为干扰对雷公藤遗传分化的影响,最终对雷公藤种质资源保存提出建议。从雷公藤的主要分布区福建、江西、浙江、湖南、贵州、云南、广西7省采集95个个体用于RAPD分子标记实验,并结合居群采样原则和空间自相关分析提出雷公藤迁地保护策略。研究成果如下:
1、将提取植物总DNA的常规CTAB法和试剂盒法结合,所得方法能够成功地从雷公藤叶片中分离出纯度高、杂质少的优质DNA。该方法排除了以往提取雷公藤DNA时多糖和酚类物质的干扰,且适用性较强。同时通过多种提取方法的试验结果对比,发现雷公藤内含物中存在某种物质能够中和提取液,从而干扰提取结果,但该物质能通过氯仿抽提消除或是减少。
2、筛选出12条随机引物对全部供试样本进行RAPD分析,一共得到118个重复性好、清晰的位点,其中多态位点共计107个,多态百分比达到91.14%;全体样本Neis基因多样性指数H=0.2973,Shannons信息指数I=0.4472,观测等位基因数Na=1.9114,有效等位基因数Ne=1.5120。4项衡量居群遗传多样性的重要指标均显示供试25个群体具有较高的遗传多样性水平;东南部种源Neis基因多样性指数和Shannons信息指数普遍高于西南部,主要是因为东南部为雷公藤制药优质药材产区,开发利用较早,杂交和引种加强了种源间的交流,而西南部种源多被高山包围,地理上不利物种间基因交流。
3、利用两种软件对供试材料进行亲缘聚类。Popgene聚类结果为广西、贵州、云南3省种源聚集在一起形成固定的西南居群区;福建种源分别和浙江、江西、湖南三省种源聚集成3个居群区。总体上看,东南地区基因交流密切,且江西、湖南两省为雷公藤和昆明山海棠的混生区,因而种源间亲缘关系较复杂。DPS聚类结果基本一致,总体保持了先个体聚集后地区聚集的态势。但福建居群明显独立,混生区聚类也更趋合理。
4、制定雷公藤种质资源迁地保护策略,需要同时考虑居群内取样数、居群数和遗传变异空间关系。基于对雷公藤遗传多样性的各项研究得出,以保存遗传多样性为主要目的的雷公藤迁地保护,每个居群的采样数需达到45才能充分代表该居群的遗传多样性;同时,不同地区的取样居群数不同,西南地区取到4个居群就能保证包含群体95%的遗传多样性,而东南地区最多需取到10个居群。对居群遗传变异空间自相关分析的结果为,在较近距离等级(738.4m)内,个体间存在相似关系,但随着距离的增大,MoransI值中正值减少而负值增多,特别在第六等级距离内出现了明显拐点,说明在1044-2350m范围内的个体不相似。尽管在后两个等级中又出现了少数正相关的MoransI值,但基于正负值总体走势,依然反应出负值的渐变模式。
5、将生长于永安国有林场的18个种源的360个个体在生长8个月后的生物量增值和器官生长各项指标作因子分析,最终得出浙江丽水、广西柳州、三明明溪、浙江衢州、浙江金华、三明清流、福建莆田、三明尤溪等地种源在永安的生长情况最好,且除去广西柳州和福建莆田,其余6个种源均被归为同一遗传分支。这说明遗传距离相近的种源,对生长环境的需求也相近。而作为本地种源,永安种源的得分处于平均水平之下,表明永安供试种源在本地并不具备生存优越性。因此,在制定保护策略时可将亲缘关系相近的种源移植到一起,同时要确保迁地保护区为雷公藤的最佳生境。