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自纳米孔问世以来,研究人员对其制备材料和方法进行了积极的研究和讨论。随着纳米制造技术的发展,制备纳米孔的材料越来越丰富。另外纳米孔具有离子渗透选择性、离子浓差极化和离子电流整流等独特电荷特性。通过对其纳米通道进行功能化基团的修饰,可以作为分析检测工具,已被应用于离子传输、药物传输、仿生离子通道和生物传感器等领域。其中基于离子整流的玻璃纳米孔在生物传感领域的应用得到了广泛关注。目前基于离子整流的纳米孔在生物传感的应用中,主要是依据DNA-蛋白质、DNA-DNA和配体-受体相互作用的传感体系,可完成蛋白质、DNA和金属离子等物质的定量检测。而利用酶对底物的特异性催化作用,实现对酶活性的检测目前还未报道。由于酶在生物化学反应中的重要作用,构建基于酶-底物相互作用的新型纳米孔传感器,从而实现酶活性的检测具有重大的现实意义。另一方面,基于离子整流的纳米孔传感器的应用中,实现纳米孔的循环再生性能已有报道,但是大部分要求的条件都非常苛刻,在温和条件下轻松实现纳米孔的循环再生性能目前仍是一大挑战,所以构建一种在温和条件下轻松实现循环再生的纳米孔传感器也是非常有必要的。所以,针对目前面临的这些问题,本论文的研究内容如下:1、玻璃锥形纳米孔的制备及其表面硅烷化研究玻璃锥形纳米孔与薄膜类固态纳米孔相比,具有制备方法简单便捷、不依靠大型仪器,且因为具有坚固的几何结构而有较高的机械性和化学稳定性。通过调节微电极拉制仪（P-2000）的设备参数,优化锥形纳米孔锥度和通道长度,以提高纳米孔检测的效果。利用光学显微镜和场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscopy,FESEM）对玻璃锥形纳米孔的形貌和孔径进行表征,结果显示在优化后的拉制条件下,可稳定获得孔径为90 nm左右的纳米孔。同时,通过电化学方法对玻璃锥形纳米孔的孔径进行测量和计算所得到的结果与FESEM表征的纳米孔直径非常吻合。通过硅羟基与硅烷化试剂的反应,可以在玻璃锥形纳米孔内表面引入功能化基团,改善玻璃表面的电荷特性,并为共价固定生物探针提供位点。本工作采用无水乙醇作为溶剂,3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、（3-缩水甘油丙氧基）三甲氧基硅烷（GPTMS）和2-[甲氧基（聚氧乙烯）丙基]三甲氧基硅烷作为硅烷化试剂对玻璃锥形纳米孔进行硅烷化处理,通过对玻璃表面亲疏水性、引入的功能化基团在生物探针固定中的作用以及对纳米孔通畅性的影响等几个方面进行分析比较。结果显示APTES硅烷化修饰可以在纳米孔内部引入氨基（-NH2）,为后续探针固定提供反应基团,同时能够避免纳米孔堵塞。最后,对APTES硅烷化反应条件进行优化,通过对纳米孔内表面氨基引入量的分析,显示最佳反应条件为1%APTES,反应时间2 h。本部分的工作为后续纳米孔的功能化修饰奠定了基础。2、构建O-磷酸-L-酪氨酸功能化玻璃锥形纳米孔无标记检测碱性磷酸酶活性目前基于离子电流整流（ionic current rectification,ICR）的玻璃锥形纳米孔的应用主要是对蛋白质、DNA和金属离子等物质的定量检测,对于酶活性的检测还尚未报道。本研究提出了一种新型的基于酶-底物相互作用的玻璃锥形纳米孔传感体系,通过检测底物在酶作用下的电荷变化,从而实现无标记检测酶的活性。首先,通过交联剂戊二醛将O-磷酸-L-酪氨酸（p-Tyr）固定在玻璃锥形纳米孔内表面。在pH中性条件下,p-Tyr分子的磷酸基团去质子化带负电荷。当待检测物中有活性碱性磷酸酶（ALP）存在时,ALP对玻璃锥形纳米孔内表面p-Tyr分子上的磷酸根进行切除,导致纳米孔内表面负电荷的减少,从而引起纳米孔的离子电流变化,结果表明在0-1.0 mU/mL检测范围内,离子电流变化率与ALP活性之间存在良好的线性关系(?I/I0=0.344 CALP+0.022,R2=0.914)。且直接测量的最低检测限为0.1 mL/mU,优于其他报道的ALP活性检测方法。通过测量p-Tyr功能化玻璃锥形纳米孔对四种常见高浓度蛋白和低活性ALP响应情况,结果显示p-Tyr功能化玻璃锥形纳米孔对ALP具有很好的选择性和特异性。实验结果表明,本工作成功构建了基于酶-底物相互作用的高灵敏ALP活性检测纳米孔传感器。此外,本工作的传感策略在表征或检测具有相似催化过程的其他酶活性方面具有很大的应用潜力。3、基于靶分子诱导适配体解离的循环再生超灵敏赭曲霉毒素A纳米孔传感器在基于离子电流整流（ionic current rectification,ICR）的纳米孔传感应用中,当使用同一传感器进行在线监测或重复测定时,纳米孔的循环再生性能是至关重要的。虽然已经实现了某些类型纳米孔的循环再生性能,但是在温和条件下轻松实现纳米孔的循环再生性能还未报道。为了解决这一问题,本工作设计了一种在温和条件下轻松实现纳米孔循环再生性能的适配体功能化玻璃锥形纳米孔传感器。首先,将能与赭曲霉毒素A（OTA）适配体通过碱基互补形成双链结构的互补DNA（cDNA:5’-CHO-TGT CCG ATG CTC CCT TTA-3’）通过氨基-醛基共价结合固定于纳米孔内表面。当OTA适配体的部分序列（TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’）与cDNA探针采用杂交互补配对的方式在玻璃锥形纳米孔内表面形成双链结构时,由于在pH中性条件下,双链DNA上的磷酸基团去质子化而带负电荷,从而纳米孔内表面显示负电荷的特性。当待测样品中OTA与纳米孔内表面上的OTA适配体的特异性识别和结合,会导致OTA适配体与其部分配对的cDNA解离,从而引起玻璃锥形纳米孔内电荷密度的变化。此时纳米孔内表面上的cDNA探针可以重新与OTA适配体互补,形成新的双链结构,完成一次循环再生,继续用于OTA检测。利用离子电流变化率表征纳米孔的循环再生性能,经过5次循环再生后,仍能很好的检测OTA,实验结果表明在温和条件下成功实现了纳米孔的循环再生性能。该传感器具有超高灵敏度和特异性。并且在1-106 pg/mL的检测范围内,该传感器直接测量的最低检测限可达1 pg/mL,优于其他工作报道的OTA检测方法。此外,在纳米孔进行生物检测过程中,纳米孔内表面的电荷密度的变化由单链cDNA探针和与其互补的适配体的结合与解脱两种状态所决定,与待检测目标物的电荷特性无关,为纳米孔传感器的构建提供了新的思路。