芎冰处方源自广州中医药大学第一附属医院心脑血管内科的临床验方脑醒Ⅱ号，由活血化瘀、开窍之川芎、丹参、冰片等药组成，后进一步修订处方，研制成芎冰喷雾剂。为了提高药物疗效，增加药物吸收和脑靶向效果，本实验室进行芎冰微乳给药系统研究。　　本课题为国家自然科学基金项目（No：30873443）部分研究内容。本实验利用微透析技术，将探针分别植入大鼠的血管和脑局部，考察芎冰微乳的体内药动学，并与川芎嗪微乳从药动学角度进行比较。制备大鼠脑缺血模型，同时测定脑局部药动学指标和药效学指标随时间变化的规律，建立脑局部同步PK/PD模型。　　本课题的实验研究分为以下四个方面：　　1.阿魏酸、川芎嗪回收率的测定及其稳定性考察　　1.1.HPLC法同时测定阿魏酸、川芎嗪的浓度　　建立HPLC法同时测定阿魏酸、川芎嗪的浓度的方法。在阿魏酸/川芎嗪质量浓度为0.0368/0.0614~1.84/3.07μg·mL-1范围内，进样量10μL情况下，所建立的方法简单、准确，专属性好。　　1.2.探针对阿魏酸、川芎嗪的回收率及其稳定性的研究　　分别考察了灌流液流速、药物浓度对探针回收率的影响，并考察10h内和5次之间探针回收率体内稳定性。结果表明随着流速的增加，探针回收率有降低的趋势，在相同的流速条件下，探针对药物的回收率和损失率相同，说明可以使用反透析法进行药物体内回收率的校正；在一定浓度范围内，药物的回收率与其浓度无关；探针回收率可以在体内保持10h相对稳定，使用五次后仍可保持相对较高的回收率，但差异较大，说明微透析法可用于阿魏酸、川芎嗪的药动学研究，每次实验后都要进行回收率的校正。　　2.大鼠脑、静脉微透析采样技术方法的建立　　新探针使用灌流液2μL?min-1的灌流速度灌流2h，使膜内外平衡浸湿并冲洗半透膜上的一些小分子。为了防止凝血对探针造成的损坏，探针在使用之前应在肝素钠注射液中浸泡20min。　　本实验选择颈静脉为血液探针植入位置。具体做法是分离颈总静脉后，结扎远心端，并在近心侧开一小口，探针从小口向着心脏方向植入约2.4cm，然后缝合即可。脑探针的植入方法是按照大鼠脑图谱，以前囟作为定位基点，坐标为(左侧纹状体)AP：+0.2mm；ML：+3.2mm；DV：-7.0mm。　　本实验选择1.5μL?min-1的流速使阿魏酸、川芎嗪皆可以获得满意的回收率，以10~20min接一份样品，样品量和浓度均可以满足本实验含量测定的需要。　　3.芎冰微乳血液药动学与脑局部药动学研究　　3.1.HPLC法同时测定透析样品中阿魏酸、川芎嗪的浓度　　采用platisil ODS色谱柱，流动相为乙腈-0.5%冰乙酸(36:64)；流速1mL·min-1，检测波长为307nm的色谱条件，阿魏酸/川芎嗪质量浓度在0.011/0.03031~3.52/4.33μg?mL-1之间线性关系良好，阿魏酸和川芎嗪精密度 RSD分别为1.23%、1.37%，最低检测限分别为12、23pg。　　3.2.微透析法同时进行芎冰微乳血液药动学与脑局部药动学研究　　采用微透析技术进行口服和静脉注射两种给药途径的芎冰微乳血液和脑局部的药动学研究，以川芎嗪微乳作为对照，采用DAS2.1药动学软件对数据进行房室模型分析及统计矩分析。　　结果表明灌胃组大鼠体内川芎嗪呈单室模型，静脉给药后体内呈二室开房模型；静注后阿魏酸在血液中呈二室模型；与单用川芎嗪相比，芎冰复方微乳可以使川芎嗪生物利用度提高33%，提高脑靶向效率，延长体内平均滞留时间。从药动学角度看，说明芎冰复方的组方是科学、合理的。　　4.芎冰制剂口服给药脑局部PK/PD模型研究　　4.1.大鼠脑缺血模型的建立　　本实验采用改良的Zea-longa线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，采用神经病学评分和脑TTC染色方法进行模型成功与否的验证。　　结果制备的脑缺血大鼠模型显示一定的神经功能症状，TTC染色后脑缺血部位被染成苍白色，说明造模是成功的。但模型成功率受到大鼠的体重、合适的线栓和实验熟练程度的影响。　　4.2.HPLC-UV法检测样品中川芎嗪含量　　采用流动相为乙腈-水(36:64)，流速1mL·min-1，检测波长为295nm的色谱条件，外标法定量；该方法在浓度为0.0155~0.465μg?mL-1范围内线性关系良好，阴性样品在川芎嗪出峰处无干扰。　　4.3.样品中氨基酸类神经递质的含量测定　　高效液相-荧光检测器系统（HPLC-FLD）OPA柱前衍生的方法测定脑透析液中EAA(Asp、Glu)、IAA(Glu、GABA、Tau)的含量，在所优化的分离条件下，各个氨基酸在测定浓度范围内浓度与峰面积线性关系良好，线性相关系数均大于0.99，样品中各氨基酸的分离度和检测限均符合大鼠纹状体脑局部微透析液中的氨基酸含量测定需要，并且样品在冷冻条件下(-20℃)储存，一周内保持稳定。　　4.4.芎冰微乳PK/PD结合模型的研究　　实验将大鼠随机分为两组：芎冰微乳组、手术对照组，芎冰微乳组灌胃给药2.0mL/kg，对照组给同样体积的生理盐水。置好探针后，平衡2h开始接4份样品作为基础值，然后开始造模，给药，同时开始接样，结束后大鼠断头取脑，TTC染色验证模型成功与否，只有成功造模的大鼠数据用于结果分析。每份样品分为两份，一份进行川芎嗪含量测定，另一份进行氨基酸类神经递质含量的测定；对照组只进行脑内氨基酸类神经递质的测定。　　结果表明，大鼠脑缺血后EAA、IAA浓度会有一定程度的升高，芎冰微乳可以显著降低脑缺血后 EAA的浓度，增加 IAA的释放，说明芎冰微乳可以通过降低 EAA的含量和增加IAA的释放来降低脑缺血的损伤，具有脑缺血保护作用。　　使用WinNonlin4.0.1药动学软件进行房室模型拟合，结果脑缺血后脑局部川芎嗪呈一级速率、单室模型，tmax约32.0min，AUC约86590.1μg/L*min。　　将得到的药动学参数输入WinNonlin软件，以川芎嗪作为药动学指标，氨基酸浓度作为药效学指标，进行PK/PD参数进行运算，以相关性R、AIC、SBC值作为指标判断拟合优度，最终拟合出 PK/PD模型符合最大效应(Emax)模型，并计算出 PK/PD结合模型参数，可用于预测川芎嗪血药浓度及其效应。