目的:乳腺癌在我国乃至全世界均位居女性恶性肿瘤前列,严重威胁女性健康。研究显示,2010年至2015年我国女性乳腺癌的发病率、病死率及患病率呈继续增长态势,因此控制、治疗乳腺癌的发生、发展刻不容缓,寻找治疗乳腺癌的靶点至关重要。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是指长度在200-100000 nt之间并且不编码蛋白质的RNA分子,但它参与细胞内多种过程的调控。其中H19基因全长2.5kb,共有5个外显子及4个内含子,H19基因产物加工生成的成熟H19全长为2.3kb,因缺乏明显的开放阅读框,被称为非编码RNA。虽然在细胞质及细胞核内都能检测到H19 RNA分子,但H19 RNA主要存在于细胞质内,以调节性RNA或核糖调节子的方式发挥功能。转移是恶性肿瘤危及生命的最主要生物学特征,它的出现,则标志着肿瘤发展的关键转折。远处转移一旦出现往往意味着肿瘤进入晚期阶段,单凭局部治疗已难以达到治愈目的。在临床治疗过程中,仍有近1/3的患者在明确恶性肿瘤诊断之初,就已经有远处转移。对于相当比例的实体恶性肿瘤患者,一旦发生转移,通常意味着临床预后不佳。因此,对于侵袭与转移全过程的细致分解,有助于未来设计更加理想的肿瘤标志物,对恶性肿瘤的早期诊断、早期治疗有重要意义。由于恶性实体瘤生长快,实体瘤所在的环境产生缺氧及酸性增加,肿瘤细胞可能会快速对抗缺氧和酸性环境,调节细胞内外p H值以及分泌血管生成因子,刺激血管内皮细胞增殖和游走运动,从而诱发新生血管生成并促使肿瘤能得到充足的血液和氧气,为向周围组织侵袭创造条件。在众多复杂的外部因素之中,缺氧是促进恶性肿瘤细胞向外生长、耐受凋亡的微环境变化。细胞对缺氧的反应包括增加缺氧诱导因子-1α(HIF-1α,hypoxia inducible factor-1α)转录复合物的稳定性,继而促进血管生成、无氧代谢、细胞生存和侵袭。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有较强再生功能和免疫调节功能的基质细胞,同时也是骨髓中造血干、祖细胞重要的支持细胞,通过分泌多种细胞因子来支持造血。MSCs是肿瘤基质的重要组成成分,也被视为肿瘤相关成纤维细胞的前体。研究显示,MSCs与多种免疫细胞,如T细胞、B细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)、单核巨噬细胞以及自然杀伤(natural killer,NK)细胞之间存在着相互作用。有实验表明,MSCs可通过分泌大量的细胞因子吸引更多的单核细胞、巨噬细胞以及中性粒细胞,从而影响肿瘤的生长。微流控芯片由微通道构成网络,以可控流体贯穿整个系统,用来取代常规生物化学实验室。它可以把样品制备、反应、分离等微缩到一块芯片上,具有高通量、集成化、可调控、易操纵的优点,是用于模拟微环境进行肿瘤转移研究的有利平台。微流控芯片目前使用的高分子有机硅化合物聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)等材料具有良好的生物相容性及对氧气和二氧化碳的通透性。细胞培养、刺激、分选和裂解等过程都可以在芯片平台上实现。微流控芯片已经成为细胞生物学研究领域极为重要的研究平台。将不同细胞在微流控芯片中共培养,从而能更好地研究细胞间的相互作用,该方法在肺癌细胞和巨噬细胞中均已报道。在本项研究中,我们利用微流控芯片技术,去探究缺氧环境中,Lnc RNA H19在间充质干细胞介导的乳腺癌转移中的作用及机制。方法:1.绘制本研究微流控肿瘤转移模型,并用相机拍摄微流控芯片实物图。对模型的各个部分进行详细说明,对微流控芯片各个通道所加的成分进行解释。2.从婴儿的脐带分离出MSCs,并进行MSCs的原代细胞培养,随后通过流式细胞仪鉴定我们所培养的细胞是否是MSCs。3.利用微流控芯片构建缺氧微环境肿瘤转移模型,把MSCs细胞种到微流控芯片的通道中,分别放在正常的细胞培养箱和含1%O2的缺氧细胞培养箱中培养。随后在微流控芯片中用免疫荧光(immunofluorescence,IF)去检测缺氧环境。4.分别用质粒去包装表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的病毒液,然后用包装好的病毒液去感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MSC,构建RFP标记的乳腺癌细胞株和GFP标记的间充质干细胞株。5.分别把RFP标记的MDA-MB-231和GFP标记的MSCs种到微流控芯片中,然后分别放到正常和缺氧的条件下去培养,观察在不同的条件下细胞的迁移情况。6.把带有RFP标记的MDA-MB-231和GFP标记的MSCs按1:1的比例混合种到微流控芯片中,然后分别放到正常和缺氧的条件下去培养,观察间充质干细胞对乳腺癌细胞转移的作用。7.用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术检测Lnc RNA H19在MSCs中的表达位置。在MSCs中,用核质分离实验分别提取出细胞质和细胞核中总的RNA,然后用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)分别检测Lnc RNA H19在细胞质和细胞核中相对表达量。分别把MSCs在1%O2的缺氧环境中培养0h、12h、24h、36h、48h,然后用RT-PCR分别检测Lnc RNA H19和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase1,MMP1)的相对表达量。在MSCs中,把H19敲降之后,用RT-PCR分别检测H19和MMP1的相对表达量。分别用micro RNA let-7的模拟物let-7mimic和micro RNA let-7的抑制物let-7inhibitor去转染MSCs,然后用RT-PCR检测MMP1的相对表达量。用荧光素梅报告基因系统检测MMP1对let-7结合位点的影响。8.用带有GFP标记能敲降H19的病毒液去感染MSCs,然后把该细胞株种到微流控芯片中,并放在含1%O2的低氧环境下培养,观察细胞的迁移情况。把带有GFP标记的sh H19的MSC和带有RFP标记的MDA-MB-231按1;1的比例混合种到微流控芯片中,然后放在含1%O2的缺氧环境下去培养,观察两种细胞的迁移情况。结果:1.左边的红色通道加含1%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培养基(dulbecco modified eagle medium,DMEM),右边的红色通道加含10%FBS的DMEM。中间的蓝色通道加含1%FBS的基质胶,把PDMS芯片和载玻片不可逆地键合在一起。2.从婴儿的脐带分离出MSCs,并进行MSCs的原代细胞培养,用流式细胞仪检测细胞表面的分子标记物,结果如下。间叶细胞的分子标记物:CD90(+),CD13(+),CD73(+),CD105(+)。细胞粘附分子标记物:CD29(+),HLA-ABC(+),CD44(+)。造血细胞的分子标记物:CD45(-),CD34(-)。内皮细胞的分子标记物:CD133(-),CD31(-)。这些结果满足MSCs表面分子标记物的要求。3.把键合好的微流控芯片放在10cm细胞培养皿中,IF实验结果显示,HIF-1α在缺氧的环境下表达水平增高。4.构建RFP标记的MDA-MB-231、GFP标记的MSCs和GFP标记的sh H19的MSCs,结果显示,这些细胞株构建的前后,细胞的形态并没有发生改变。5.连续观察4天,微流控结果显示,在缺氧条件下,MDA-MB-231和MSCs的迁移距离比对照组大。6.连续观察4天,微流控结果显示,不管在正常情况下还是缺氧条件下,MSCs都在MDA-MB-231的前面。并且在缺氧条件下,MSCs和MDA-MB-231都比对照组迁移的远。7.FISH结果显示,H19主要在细胞质中表达。在核质分离实验中,RT-PCR结果显示,H19在细胞质中的相对表达水平远高于细胞核。MSCs在1%O2的缺氧环境中分别培养0h、12h、24h、36h、48h后,RT-PCR结果显示,H19和MMP1的相对表达量随低氧时间的延长而逐渐增大,并且MMP1的增加幅度没有H19大。RT-PCR结果显示,let-7能够降低MMP1的表达量。荧光素梅报告基因系统结果表明,MMP1和let-7有结合位点。8.连续观察3天,微流控结果显示,在缺氧条件下,把H19敲低之后,MSCs的迁移距离变短。在MSCs和MDA-MA-231共培养的那一组中,在缺氧条件下,把H19敲低之后,MSCs的迁移距离变短,相应地MDA-MB-231的迁移距离也变短。结论:实验结果表明,间充质干细胞能够促进乳腺癌细胞的迁移,在缺氧条件下,这种效果更明显,且Lnc RNA H19的异常激活及高表达是间充质干细胞介导乳腺癌细胞迁移的重要因素之一。