随着对癫痫认识与研究的不断深入，临床发现很多癫痫患者除临床发作症状外，还伴有学习记忆能力减退、情感行为异常、注意力分散及社会适应能力下降等多种认知功能受损的表现，影响患者身心健康与康复，但临床缺乏针对性生的治疗方药，因此，进行相关的实验研究与药物开发具有重要的临床意义。中医药在控制癫痫发作、调节患者神经功能、减少化学药品的毒副作用以及改善学习记忆、调节焦虑等精神心理障碍等方面已取得可喜的成果，研究探讨中医药改善癫痫这一特定状态下，患者学习记忆等认知功能障碍，将具有较强的实用价值。印防己毒素(picrotoxin，PTX)化学点燃癫痫模型是一种与人类癫痫发生、形成具有高度相似性的慢性癫痫模型，该模型用于观察癫痫学习记忆障碍基础和药物研究已有多家报道，我们以此模型为基础，进行相关的药理学研究，试图对临床用药起到指导作用。 我们认为癫痫属于“伏邪杂病”，以浊毒内伏脑络、脑神失养导致学习记忆障碍、情感异常，应用印防己毒点燃慢性癫痫大鼠模型，通过大鼠行为学实验、病理组织学、免疫组织化学、免疫印记吸附、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)以及电镜超微结构等观察方法，观察调肝解毒方药(天冰调督胶囊)对学习记忆、情感认知行为、以及脑海马等组织脑源性神经营养因子(BDNF)、乙酰胆碱脂酶(AchE)、神经肽Y(NPY)、腺苷Al受体、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)、N-甲基D-氨基天氡氨酸受体(NMDAR1)等表达影响，探讨其可能的作用机制，为临床治疗提供依据。 本研究分六个部分，现将各部分研究内容概述如下。 一、调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠记忆情感行为改变的影响 目的：观察调肝解毒方药对印防己毒点燃癫痫模型大鼠情感行为、学习记忆改变的影响，探讨其可能的作用机制。 方法：选用健康雄性Sprague-Dawley大鼠，100只，起始体重120±10g，随机分组。正常组20只，腹腔注射等容积生理盐水；PTX点燃组80只，按文献方法，每天上午10：00至11：30腹腔注射PTX1.5mg/kg，连续注射20～30天，达到完全点燃时停止造模。注射20天起录像机观察大鼠行为动态变化。点燃行为依据Racine分级标准分为五级，凡已获得连续3次4级或4级以上完全发作者，被认为完全点燃。随机选取正常组和点燃模型大鼠进行发作间期EEG描记，以确定模型点燃成功。随机选取点燃成功大鼠72只，分为模型组、调肝低量组(TGDL组)、调肝高量组(TGGL组)、丙戊酸钠组(VPA组)，每组18只。正常组大鼠18只同期观察。调肝解毒方药(天冰调督胶囊)主要成份为柴胡、桂枝、天麻、全蝎、人工牛黄、黄连、绞股蓝等，由制剂室提供浓缩浸膏。正常组、模型组灌服生理盐水(10 ml/kg体重)；调肝低量组、调肝高量组分别以混悬液(1.2g/kg、4.8g/kg生药量)灌胃；丙戊酸钠组以(0.008g/kg)混悬液灌胃给药。在造模第30天开始用药观察，观察治疗60天后检测行为学指标。以旷场实验、抬高迷宫实验了解大鼠情感行为改变；交替电刺激Y型电迷宫实验、Morris水迷宫实验了解大鼠学习记忆改变情况。 结论：成功复制出印防己毒点燃癫痫大鼠学习记忆与情感行为异常模型，该模型大鼠具有警觉水平降低、情感行为异常及学习记忆能力受损等认知功能受损的表现，调肝解毒方药可改善癫痫大鼠学习记忆与情感行为异常。 二、调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠脑源性神经营养因子、乙酰胆碱脂酶表达的影响 目的：观察调肝解毒方药对印防己毒点燃癫痫模型大鼠脑源性神经营养因子、乙酰胆碱脂酶表达的影响，探讨其可能的作用机制。 方法：印防己毒慢性癫痫大鼠模型的制备及给药方法同第一部分。在治疗与行为学指标测试后，正常组、丙戊酸纳组各9只、模型组、调肝低量组、调肝高量组各8只大鼠，应用免疫组织化学方法，检测各组脑海马组织BDNF、AchE、胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达情况。各组大鼠深度麻醉，暴露心脏，自升主动脉插管，生理盐水冲洗；4％多聚甲醛磷酸缓冲液灌流固定，取嗅脑至中脑之间脑组织，相同灌流液固定，沉底。切取视交叉和乳头体处垂直横断脑组织，做冠状连续冰冻切片，切至海马结构，每片厚度为40t姗。分为六套，进行BDNF、AchE、ChAT等指标免疫组织化学染色。统计各切片固定区域免疫阳性细胞数。 结论：点燃癫痫模型大鼠存在脑BDNF、AchE、ChAT表达异常，调肝解毒方药可能通过调节脑BDNF表达或改善胆碱能神经系统功能起到改善学习记忆功能。 三、调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠神经肽Y、腺苷Al受体表达的影响 目的：观察调肝解毒方药对印防己毒点燃癫痫模型大鼠神经肽Y、腺苷Al受体表达的影响，探讨其可能的作用机制。 方法：模型制备及给药方法同第一部分。在治疗及行为学指标测试后，应用免疫组织化学方法(取材等方法同第二部分)和Western blot方法，检测各组脑海马等组织神经肽Y、腺苷Al受体表达情况。Westem blot方法检测，随机选取每组6只大鼠，深度麻醉，取脑，液氮保存。冰盘取脑，超声破碎，离心分装，-20℃保存。测定蛋白浓度。进行蛋白SDS电泳检测，(考马斯亮兰染色比较上样量)。PVDF膜处理。TBST沈膜，分别加入一抗NPY、腺苷A1受体。洗膜及处理。DAB显色。图象分析系统检测各组阳性条带用Max OD值，统计分析。 结论：经两种检测方法证实，点燃癫痫模型大鼠存在脑NPY、腺苷AlR表达的异常，调肝解毒方药可能通过调节脑NPY、腺苷A1R表达起到改善学习记忆、情感行为异常的作用。 四、调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠海马CREB，NMDAR1表达的影响 目的：观察调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠海马组织CREBmRNA、NMDAR1 mRNA表达、磷酸化的pCREB、 NMDAR1表达的影响，探讨其可能的作用机制。 方法：各组以免疫组织化学方法测定脑组织pCREB、NMDAR1表达。以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测大鼠海马组织CREBmRNA、NMDAR1mRNA表达。以随机选取经治疗后认知行为检测结束(每组6只)大鼠，深度麻醉，冰台分离海马，液氮保存。RNA提取及其检测参照Trizol试剂说明书，依程序提取海马总RNA，提取RNA的完整性检测。测量RNA纯度和含量，选用OD<,250>/OD<,280>比值为1.8～2.0的RNA用作反转录。按照反转录系统试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，合成扩增NMDARl与CREB cDNA的引物序列，RT-PCR产物半定量，凝胶成像系统扫描并摄像，确定各组扩增物相对量，统计结果。 结论：从不同层次与水平观察到点燃癫痫模型大鼠存在海马组织CREB与NMDAR1表达的异常，调肝解毒方药可能通过调节CREB与NMDAR1水平改善癫痫学习记忆等认知障碍。 五、调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠海马病理组织学与超微结构改变的影响 目的：观察调肝解毒方药对点燃癫痫模型大鼠海马病理组织学与超微结构改变的影响，探讨其可能的作用机理。 方法：模型制备及给药方法同第一部分。脑组织灌注和取材、切片与第二部分免疫组织化学染色方法相同。尼氏染色以冷冻切片贴附于载玻片，梯度脱水，1％克紫染色，透明封片。用改良的Timm染色方法染色，各组检测指标依据Gregory苔藓纤维发芽(MFS)分级标准。透射电镜标本制作和海马超微结构观察，随机选取大鼠(每组3只)深度麻醉，处死动物，在断血供后2分钟之内，将海马组织切成1 nm<3>的小块，4％戊二醛固定，PBS充分清洗，1％锇酸固定，PBS充分清洗，梯度脱水，包埋，聚合，切片厚度50nm，双重电子染色，透射电镜观察、照相、分析结果。 结论：癫痫大鼠神经元尼氏体脱失、苔藓纤维发芽及海马突触可塑性改变可能是其学习记忆障碍的重要病理因素。调肝解毒方药可能通过改善模型大鼠神经元功能、抑制苔藓纤维发芽、改善海马突触活性，影响突触可塑性，达到改善学习记忆目的。 六、毒邪可伏蕴为痫，调肝解毒疗痫呆--调肝解毒方药治疗癫痫认知障碍的中医理论探讨 目的：依据传统中医理论，结合临床和实验结果，探讨新学说与方法的可行性。 方法：温习和回顾了中医理论，从癫痫的病因、病机、治法、方药治疗等角度论证癫痫与“浊毒”伏邪的关系，进而提出新的观点与治疗方法。 结论：癫痫属“伏气”杂病，由于“浊毒”内伏、肝失调达、毒损脑络、脑神失养，导致癫痫认知障碍。调肝解毒方药治疗癫痫认知障碍，可通过调肝解毒，化邪毒，息肝风，止抽搐，疗痫呆。并是多途径、多靶点、多环节的调节作用。