我国嗜热弯曲菌PCR和核酸探针检测方法的建立与应用

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:haoyigyaoatcs31
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空肠弯曲菌和结肠弯曲菌是我国主要的嗜热弯曲菌,可以引起人和动物发生多种疾病,并且是食物源性病原菌,在一定范围上所引起的食源性细菌感染已超过沙门氏菌,成为在腹泻病人中最常分离到病原菌,对禽类产品安全和人类健康造成了严重的威胁。目前,嗜热弯曲菌已成为我国进出口禽类产品检测的主要病原菌之一。 在出入境检验检疫中,样品中的病原菌检验,按现行标准(GB国家标准和SN行业标准),然而传统方法中难免有操作繁琐、步骤多、检验周期长的问题,不能满足大批样品检验检疫的需要是对外贸易的一个急待解决的制约因素。 本研究建立了检测我国嗜热弯曲菌的PCR和核酸探针检测方法,简化了检验流程、提高检测效率,并应用于实际样品的检测。选择空肠/结肠弯曲菌同源性较高的16SrRNA为扩增目的基因,应用Primer5.0软件设计引物,建立快速检测鸡肉中空肠/结肠弯曲菌的PCR方法。PCR循环参数为:94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min,25个循环后再72℃彻底延伸4min。最佳反应条件为:模板10-(3)倍稀释,引物最佳浓度为0.4gmol/L,MgCl2最佳浓度为1.0mmol/L。该方法能够特异性的扩增出空肠/结肠弯曲菌287bp核苷酸片段,而对胎儿弯曲菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、产气夹膜梭菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓假单胞菌和单核细胞增生性李斯特氏菌等非空肠/结肠弯曲菌均不能扩增出目的片段,敏感性试验的检测限度为5cfu/mL。 在PCR方法建立的基础上,在已扩增的特异性和敏感性较好的空肠/结肠弯曲菌16SrRNA上设计核酸探针,探针大小21bp,具有寡核苷酸探针的优点。此方法利用化学发光物质吖啶酯标记寡核苷酸探针,所设计的探针能够与目的核苷酸探针杂交,形成DNA-RNA杂交体,杂交后无需分离步骤,利用差分水解(Differential hydrolysis)鉴别,即先加入弱碱性溶液,未经杂交的发光探针失去发光特性(半衰期小于1min),而与靶细胞杂交的探针可以保护吖啶酯不在碱性环境下水解。因为吖啶酯平面结构镶嵌于杂交体双螺旋的内部,受到空间位阻的保护,水解速度缓慢(半衰期10min以上),仍有发光性能,再加入碱性H2O2进行检测时,能够在发光仪上检测到发光,整个试验过程只需要30min。此方法称为核酸杂交保护分析,目前在我国还很少应用。 取空肠弯曲菌标准株的纯培养菌落进行核酸杂交保护分析的试验,通过条件
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